張瑤，陳晟，吳丹，何淼，朱孔亮，陳堅，吳敬

1 江南大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，無錫 214122

2 江南大學生物工程學院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，無錫 214122

滌綸 (Poly (ethylene terephthalate)，PET) 是世界上需求量最大的合成纖維之一[1]。作為一種服用性纖維，滌綸具有很多優(yōu)良的特性，如強度高、彈性好、耐拉伸、抗皺耐磨、抗有機溶劑、耐熱耐腐蝕等等。然而，由于滌綸內(nèi)部分子排列緊密，結(jié)晶度高，結(jié)構(gòu)中無高極性基團，因此親水性較差，這就在很大程度上限制了它的舒適性、可染性等[2-5]。為了改進滌綸的親水性和染色性，必須對其進行表面改性。傳統(tǒng)化學處理方法，需要消耗大量的能源，對生態(tài)環(huán)境造成嚴重威脅。近來，生物酶處理作為一種節(jié)能降耗、環(huán)境友好的紡織品清潔生產(chǎn)技術(shù)，已成為國內(nèi)外染整行業(yè)發(fā)展的新趨勢[3,5-6]。

角質(zhì)酶作為一種多功能解酯酶，可以水解滌綸表面的酯鍵，能有效提高織物親水性，改善纖維品質(zhì)[2-7]。角質(zhì)酶用于紡織纖維改性的研究主要以發(fā)現(xiàn)最早、研究最為廣泛的茄病鐮刀菌 Fusarium solani角質(zhì)酶為研究對象[8-13]。后來的研究發(fā)現(xiàn)來自尖孢鐮刀菌 Fusarium oxysporum[14-15]、植物病原真菌Pyrenopeziza brassicae[16-17]和腐質(zhì)霉菌 Humicola insolens[18]的角質(zhì)酶同樣能用于滌綸的改性，提高滌綸纖維的親水特性。然而真菌來源的角質(zhì)酶耐熱性差、生長周期長、生產(chǎn)成本高等問題使角質(zhì)酶在纖維改性中的應(yīng)用受到了限制。本實驗室前期成功鑒定了來源于嗜熱子囊菌 Thermobifida fusca WSH 03-11的耐熱角質(zhì)酶編碼基因，并將該基因克隆表達于E. coli BL21(DE3) 中[19]。重組T. fusca角質(zhì)酶表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性和酸堿抗性，在紡織纖維改性中具有潛在的應(yīng)用前景[19-20]。

本研究考察了重組大腸桿菌在搖瓶及3 L發(fā)酵罐中生產(chǎn)角質(zhì)酶的調(diào)控策略，并探討了細菌來源角質(zhì)酶對滌綸纖維表面改性的處理效果。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

大腸桿菌 BL21(DE3) 含 pET-20b(+)/Tfu_0883重組質(zhì)粒作為生產(chǎn)菌種。該菌株由江南大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室構(gòu)建及保藏。

種子培養(yǎng)基 (g/L)：工業(yè)級蛋白胨 10，工業(yè)級酵母粉5，NaCl 10，氨芐青霉素0.1，pH 7.1。

TB發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：甘油 6，工業(yè)級蛋白胨12，工業(yè)級酵母粉24，KH2PO42.31，K2HPO43H2O 16.43，氨芐青霉素0.1，pH 7.1。

補料液 (g/L)：甘油 500。乳糖誘導液 (g/L)：乳糖 200。IPTG誘導液 (mmol/mL)：IPTG 0.5。

1.2 材料與試劑

滌綸織物：無錫市益宏化纖有限公司提供，115 g/m2工業(yè)級酵母粉購于宜昌安琪酵母有限公司；工業(yè)級蛋白胨購于上海西王淀粉糖有限公司；氨芐青霉素購于上海生工生物工程有限公司；亞甲基藍(上海染料廠)；其他常規(guī)試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 種子液

將?80 ℃甘油管保存的菌種接100 μL菌液于50 mL (250 mL錐形瓶) 含100 μg/mL Amp的種子培養(yǎng)基中，使用回轉(zhuǎn)恒溫調(diào)速搖床進行培養(yǎng)；控制轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)溫度37 ℃，初始pH值7.1，培養(yǎng)時間6~8 h。

1.3.2 搖瓶培養(yǎng)

將種子液以5%的接種量加入50 mL (250 mL錐形瓶) TB培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)3 h，當菌體生長到對數(shù)生長期 (OD600≈1) 時，加入誘導劑開始誘導。繼續(xù)培養(yǎng)至7 h，當菌體生長到對數(shù)生長期 (OD600≈5) 時添加 0.5%甘氨酸。搖床轉(zhuǎn)速與培養(yǎng)溫度不變。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)

分批培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液按 5%接種量接入3 L全自動發(fā)酵罐NBS (New Brunswick Scientific Co., Ltd，美國) 中進行發(fā)酵培養(yǎng) (裝液量1 L)。向發(fā)酵罐中通入無菌空氣，通氣量1.5 L/min，控制攪拌轉(zhuǎn)速維持溶氧濃度在 20%~30%左右，流加質(zhì)量濃度為 1 000 g/L的氨水控制發(fā)酵培養(yǎng) pH 在7.0~7.1。5 h后添加0.5%甘氨酸，6 h后加入乳糖至終濃度為2 g/L進行誘導。

補料分批培養(yǎng)：1 L TB培養(yǎng)基中以10%接種量接入種子液后進行分批培養(yǎng)，甘油耗盡后 (溶氧徒然上升) 流加生長培養(yǎng)基，并維持甘油濃度2~3 g/L左右。6 h后開始添加0.5%甘氨酸。當OD600=30時開始流加 2 g/L乳糖誘導液。生長和誘導溫度均為30 ℃。整個發(fā)酵過程由發(fā)酵罐控制系統(tǒng)軟件進行在線控制和數(shù)據(jù)采集。

1.4 分析方法

1.4.1 菌體生物量的測定

采用分光光度計檢測菌液定在 600 nm波長處的吸光度值，即OD600，以此測定菌體的生物量。

1.4.2 角質(zhì)酶發(fā)酵液酶活測定

發(fā)酵液經(jīng)12 000 r/min 離心10 min，上清液為粗酶液，用于后續(xù)酶活測定。酶活測定采用連續(xù)分光光度法。反應(yīng)液體積為1 mL，包括20 μL粗酶液和 980 μL 50 mmol/L的硫磺脫氧膽酸鈉緩沖液(pH 8.0，含50 mmol/L對硝基苯丁酸酯)。20 ℃反應(yīng)1 min后，在波長405 nm處記錄對硝基酚的生成速率。酶活定義：20 ℃時每分鐘催化對硝基苯丁酸酯水解生成1 μmol對硝基苯酚的酶量即為一個酶活力單位。

1.4.3 甘油及乳糖濃度測定

安捷倫高效液相色譜 (HPLC)，色譜條件為色譜柱：Shodex Sugar SH1011，流動相：0.01 mol/L H2SO4，流速：0.8 mL/min，柱溫：50 ℃，進樣量：5 μL，檢測器：示差折光檢測器，檢測器溫度：30 ℃。

1.5 滌綸的角質(zhì)酶處理工藝及性能測試

1.5.1 角質(zhì)酶處理滌綸織物

將1 g 滌綸織物在60 ℃水浴振蕩清洗30 min后，按浴比1∶40放入磷酸鹽緩沖液 (pH 7) 中。取一定劑量 (400 U) 的角質(zhì)酶發(fā)酵罐培養(yǎng)液上清至上述處理液中，使角質(zhì)酶最終酶濃度為 10 U/mL；用Triton X-100表面活性劑來增強酶的活性，濃度為0.1% (W/V)。密封置于水浴恒溫振蕩器中處理3 h，取出纖維，用60 ℃蒸餾水充分洗滌。

1.5.2 滌綸織物的染色

將處理后的滌綸織物于50 ℃振蕩水洗1 h后，浸入40 mL染液中染色5 h。取出織物用50 ℃去離子水洗20 min，重復(fù)3次，然后在60 ℃烘箱中平衡2 h。

染色條件：亞甲基藍，濃度0.05 g/L，pH 6.0，浴比1∶40。

1.5.3 測試方法

角質(zhì)酶處理殘液紫外吸光度的測定：用紫外分光光度計測試不同處理時間下 240 nm處的紫外吸光度值。參比樣為相同條件下不加入滌綸纖維的角質(zhì)酶處理液。

潤濕性能 (滴水時間) 按AATCC 79-1979測定。

上染率用UV-2100紫外可見分光光度計測定，以空白染浴的吸光值為基準計算上染率。

2 結(jié)果

2.1 IPTG和乳糖誘導效果比較

將種子接入種子培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)過夜，后接入發(fā)酵培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)至OD600達1.0后，分別用終濃度0.4 mmol/L IPTG和5 g/L乳糖進行誘導 (圖1)。從圖1中可知，發(fā)酵20 h時，無論添加何種誘導劑，菌體生長都達到最大值，此后菌體生長進入平衡期，50 h菌體開始衰亡。IPTG對菌體生長有較明顯的抑制作用，而乳糖對菌體生長影響較小。以IPTG或乳糖作為誘導劑，角質(zhì)酶酶活50 h達最高值，分別為120 U/mL和96 U/mL。由于IPTG價格昂貴并對菌體生長有明顯的抑制作用，而乳糖沒有毒性，價格低廉，可用于工業(yè)化生產(chǎn)，因而本研究選用乳糖作為誘導劑進行后續(xù)研究。

圖1 IPTG 或乳糖誘導的重組大腸桿菌生長 (A) 及產(chǎn)角質(zhì)酶情況 (B)Fig. 1 Growth and cutinase production by IPTG or lactose induction. (A) The growth of E. coli. (B) The cutinase production.

2.2 乳糖濃度及誘導時間對角質(zhì)酶產(chǎn)量的影響

根據(jù)文獻報道[21-22]，過高或過低的乳糖濃度都會影響酶表達量。為進一步確定合適的乳糖誘導濃度，分別以1~20 g/L不同濃度的乳糖進行誘導。從圖2中看出，乳糖濃度為2 g/L時，角質(zhì)酶的表達量最大，達102 U/mL。隨著乳糖濃度的增大，角質(zhì)酶的表達量逐漸降低，菌體量也下降 (數(shù)據(jù)未顯示)，說明高濃度乳糖對菌體生長有一定的抑制作用，這同以往的研究一致[21-22]。

實驗考察了在菌體對數(shù)生長前期 (OD600≈1)、中期 (OD600≈5) 和后期 (OD600≈8) 分別添加2 g/L乳糖誘導對角質(zhì)酶產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，在菌體對數(shù)生長后期加入乳糖誘導，重組角質(zhì)酶的表達量略高于前期和或中期乳糖誘導的表達量。

圖2 不同乳糖濃度對大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)角質(zhì)酶的影響Fig. 2 Cutinase production of E. coli by lactose induction at different concentrations.

2.3 甘氨酸對角質(zhì)酶產(chǎn)量的影響

據(jù)文獻報道[23]，甘氨酸可導致大腸桿菌細胞膜透性的明顯增加，能提高重組蛋白的胞外產(chǎn)量和生產(chǎn)強度。程婧等[24]前期實驗結(jié)果表明在對數(shù)生長前期添加甘氨酸能提高蛋白的胞外表達量。為能進一步提高角質(zhì)酶的產(chǎn)量，考察了甘氨酸對乳糖誘導下的重組大腸桿菌生長及產(chǎn)角質(zhì)酶的影響。如圖 3所示，在菌體生長的對數(shù)前期 (OD600≈5) 添加0.5%甘氨酸和終濃度2 g/L乳糖后，菌體生長沒有受到明顯影響，角質(zhì)酶酶活持續(xù)增加，最終達到128 U/mL。

2.4 分批發(fā)酵培養(yǎng)

在搖瓶實驗的基礎(chǔ)上，在3 L發(fā)酵罐內(nèi)，采用工業(yè)級 TB培養(yǎng)基，進一步進行了重組大腸桿菌產(chǎn)角質(zhì)酶分批發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果見圖4。發(fā)酵培養(yǎng)5 h至OD600≈8時添加0.5%甘氨酸，當進入菌體對數(shù)生長后期 (OD600≈12) 時加入終濃度 2 g/L乳糖進行誘導。結(jié)果表明，發(fā)酵 6 h后培養(yǎng)基中的甘油幾乎消耗殆盡，此時溶氧開始上升。但由于乳糖作為誘導劑的同時，本身也是一種碳源，可以被菌體利用[21]，因此生物量維持穩(wěn)定，角質(zhì)酶的表達量開始逐漸增

圖3 甘氨酸對乳糖誘導下大腸桿菌生長及產(chǎn)角質(zhì)酶的影響Fig. 3 Growth and cutinase production of E. coli by lactose induction and glycine addition.

加。發(fā)酵16 h后，酶活快速增長，至發(fā)酵28 h時達到最大值，為180 U/mL。

2.5 分批補料發(fā)酵培養(yǎng)

在分批發(fā)酵生產(chǎn)角質(zhì)酶的過程中，由于甘油完全不能滿足菌體生長需求，所以菌體生物量和產(chǎn)酶量較低。為進一步提高角質(zhì)酶的產(chǎn)量，進行了補料發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)角質(zhì)酶的研究。甘油作為菌體生長的碳源尤為重要，但高濃度的甘油對菌體生長不利，因而將甘油濃度控制到較低水平，可以有效利用原料，解除底物抑制，提高產(chǎn)物水平[25]。本實驗中發(fā)酵培養(yǎng)約6 h后，待溶氧陡然上升，開始以1.5 g/h的速率補加甘油補料液，隨著生物量的增長，逐步提高補料速率。發(fā)酵培養(yǎng)且自補料開始，每隔1小時，對發(fā)酵液中甘油濃度進行一次測定，使發(fā)酵液中甘油濃度維持在2~4 g/L。進入對數(shù)生長期后，隨著代謝產(chǎn)物的增多，發(fā)酵液pH會下降，需加入氨水以維持pH在7左右。此時，也需通入純氧將溶氧濃度維持在 20%~30%，為菌體生長提供足夠的氧氣。發(fā)酵培養(yǎng) 6~7 h (OD600=15) 后，采用一次性添加的方式，加入0.5%甘氨酸。在對數(shù)生長后期，生物量達到OD600=30時，加入乳糖開始誘導。由搖瓶實驗結(jié)果可知，高濃度乳糖存在抑制效應(yīng)，故乳糖以0.8 g/h速率進行補加。發(fā)酵每隔 1小時，測定一次發(fā)酵液中乳糖濃度，使發(fā)酵液中乳糖濃度維持在2~3 g/L。結(jié)果如圖5所示，在整個發(fā)酵過程中，隨著限制性碳源甘油的加入，OD600值呈線性增加，發(fā)酵12 h，OD600達到最大值35，隨后OD600保持穩(wěn)定。角質(zhì)酶的表達量在誘導8 h后大幅增加，至發(fā)酵30 h酶活達到最高，為506 U/mL，比分批發(fā)酵培養(yǎng)提高了2.81倍。

圖4 分批發(fā)酵培養(yǎng)重組大腸桿菌的生物量及角質(zhì)酶產(chǎn)量Fig. 4 Growth and cutinase production of E. coli in batch culture.

圖5 分批補料發(fā)酵培養(yǎng)重組大腸桿菌的生物量及角質(zhì)酶產(chǎn)量Fig. 5 Growth and cutinase production of E. coli in fed-batch culture.

2.6 角質(zhì)酶處理滌綸纖維反應(yīng)液的紫外分析

采用上述補料培養(yǎng)角質(zhì)酶發(fā)酵液處理滌綸織物，進一步開展角質(zhì)酶對滌綸表面改性的研究。Yoon等[1]和Alisch等[5]研究表明，滌綸的水解產(chǎn)物對苯二甲酸及其酯在240 nm處有強烈的吸收峰，因此測定了角質(zhì)酶處理液在240 nm下的紫外吸光度變化，以表示角質(zhì)酶對滌綸的處理效果。結(jié)果如圖 6所示，隨著處理時間的延長，紫外吸光度隨之上升，但當處理時間大于12 h時，紫外吸光度的增加逐漸趨于平緩。這說明反應(yīng)初期底物釋放的小分子對苯二甲酸衍生物類化合物的量隨處理時間的延長而增大，從而證明了角質(zhì)酶可以催化作用于滌綸纖維。當纖維表面酯鍵水解到一定程度時，即使再延長處理時間，反應(yīng)產(chǎn)物量也不會增加，紫外吸光度曲線逐漸趨向平緩。

圖6 角質(zhì)酶對滌綸水解反應(yīng)的紫外吸光度Fig. 6 UV absorbency after hydrolysis of PET by cutinase.

2.7 角質(zhì)酶處理對滌綸纖維潤濕性能的影響

紫外吸光度分析結(jié)果表明，角質(zhì)酶可以催化滌綸纖維的水解，使滌綸纖維表面上的羧基和羥基增加，從而提高滌綸的親水性。本研究通過滴水試驗對角質(zhì)酶處理效果進行評價，結(jié)果如圖所 7示。實驗發(fā)現(xiàn)，僅用緩沖液空白液試樣和失活角質(zhì)酶試樣處理的滌綸親水性改變不大，說明酶蛋白和滌綸纖維之間的吸附作用較小。角質(zhì)酶單獨處理樣與Triton X-100單獨處理樣的潤濕時間均在30~40 s，兩者聯(lián)合處理后潤濕時間降至5 s。這說明，角質(zhì)酶和表面活性劑協(xié)同作用能有效降低滌綸表面張力，提高對角質(zhì)酶的親和力，從而增強對滌綸的處理效果，與劉延波等的研究結(jié)果一致[18]。

2.8 角質(zhì)酶處理對滌綸纖維染色性能的影響

圖7 角質(zhì)酶處理對滌綸潤濕時間的影響Fig. 7 Effect of cutinase treatment on wetting time of PET.

圖8 角質(zhì)酶處理對滌綸上染率的影響Fig. 8 Effect of cutinase treatment on dyeing percent of PET.

據(jù)文獻報道[4-5,9]，角質(zhì)酶處理滌綸纖維可以使其染色性能得到提高。本文通過測定染液的吸光度值計算上染率，以此衡量角質(zhì)酶對滌綸纖維的水解程度，結(jié)果見圖 8。由圖 8可知，與對照樣相比，失活酶處理樣的上染率變化不大，這說明滌綸在整個酶處理及洗滌過程中酶吸附的干擾較小。角質(zhì)酶處理樣的上染率均高于對照樣和失活樣，這是由于角質(zhì)酶催化水解滌綸纖維表面產(chǎn)生了羧基和羥基基團。而羧基結(jié)構(gòu)可以與陽離子染料中的陽離子基團發(fā)生吸附作用，從而達到使纖維染色的目的。表面活性劑Triton X-100單獨處理的滌綸纖維染色性能很差，這是因為Triton X-100處理滌綸表面并不能產(chǎn)生羧基和羥基親水基團，因而不能與陽離子染料結(jié)合進行染色。但Triton X-100與角質(zhì)酶共同作用滌綸的效果要好于角質(zhì)酶單獨作用，這是因為Triton X-100是良好的纖維滲透劑，有助于酶“接近”纖維，從而提高角質(zhì)酶處理滌綸的效果。

3 結(jié)論

本研究考察了重組 T. fusca角質(zhì)酶發(fā)酵的搖瓶誘導條件、分批培養(yǎng)和分批補料培養(yǎng)調(diào)控策略，以及角質(zhì)酶處理滌綸纖維的潤濕性能和染色性能。

搖瓶發(fā)酵采用工業(yè)級TB培養(yǎng)基，用2 g/L乳糖誘導，菌體培養(yǎng)至對數(shù)生長前期添加0.5%甘氨酸，角質(zhì)酶產(chǎn)量可以達到128 U/mL。在3 L發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)中，分批培養(yǎng)角質(zhì)酶產(chǎn)量為180 U/mL；補料培養(yǎng)生物量 (OD600) 最大達到35，角質(zhì)酶酶活最高達506 U/mL，該酶活是迄今國內(nèi)外報道細菌來源角質(zhì)酶的最高水平。

本文在國內(nèi)首次報道了細菌來源角質(zhì)酶對滌綸纖維改性的研究。紫外分光光度法分析結(jié)果初步表明，滌綸纖維經(jīng)角質(zhì)酶水解產(chǎn)生了對苯二甲酸類物質(zhì)。角質(zhì)酶處理滌綸纖維的滴水性和染色性均明顯高于對照樣，說明角質(zhì)酶的作用效果較為明顯。且角質(zhì)酶與 Triton X-100聯(lián)合作用，能顯著提高滌綸的潤濕性和染色性。

REFERENCES

[1] Yoon MY, Kellis J, Poulose AJ. Enzymatic modification of polyester. AATCC Rev, 2002, 2(6): 33?36.

[2] Silva C, Cavaco-Paulo PA. Biotransformations in synthetic fibers. Biocatal Biotransform, 2008, 26(5): 350?356.

[3] Araújo R, Casal M, Cavaco-Paulo A. Application of enzymes for textile fibres processing. Biocatal Biotransfor, 2008, 26(5): 332?349.

[4] Guebitz MG, Cavaco-Paulo A. Enzymes go big: surface hydrolysis and functionalisation of synthetic polymers. Trends Biotechnol, 2008, 26(1): 32?38.

[5] Alisch M, Feuerhack A, Müller H, et al. Biocatalytic modification of polyethylene terephthalate fibres by esterases from actinomycete isolates. Biocatal Biotransfor, 2004, 22(5/6): 347?351.

[6] Mueller RJ. Biological degradation of synthetic polyesters-enzymes as potential catalysts for polyester recycling. Proc Biochem, 2006, 41(10): 2124?2128.

[7] Carvalho CM, Aires-Barros MR, Cabral JM. Cutinase: from molecular level to bioprocess development. Biotech Bioeng, 1999, 66(1): 17?34.

[8] Nimchua T, Punnapayak H, Zimmermann W, et al. Comparison of the hydrolysis of polyethylene terephthalate fibers by a hydrolase from Fusarium oxysporum LCH I and Fusarium solani f. sp. pisi. Biotechnol J, 2007, 2(3): 361–364.

[9] O’Neill A, Araújo R, Casal M, et al. Effect of the agitation on the adsorption and hydrolytic efficiency of cutinases on polyethylene terephthalate fibres. Enzyme Microb Tech, 2007, 40(7): 1801?1805.

[10] Eberl A, Heumann S, Brückner, et al. Enzymatic surface hydrolysis of poly (ethylene terephthalate) and bis (benzoyloxyethyl) terephthalate by lipase and cutinase in the presence of surface active molecules. J Biotechnol, 2009, 143(3): 207?212.

[11] Vertommen MAME, Nierstrasz VA, Veer MVD, et al. Enzymatic surface modification of poly (ethylene terephthalate). J Biotechnol, 2005, 120(4): 376?386.

[12] Alisch-Mark M, Herrmann A, Zimmermann W. Increase of the hydrophilicity of polyethylene terephthalate fibres by hydrolases from Thermomonospora fusca and Fusarium solani f. sp. pisi. Biotechnol Lett, 2006, 28(10): 681?685.

[13] O’Neill A, Cavaco-Paulo A. Monitoring biotransformations in polyesters. Biocatal Biotransfor, 2004, 22(5/6): 353?356.

[14] Piod TF, Macedo GA. Optimizing the production of cutinase by Fusarium oxysporum using response surface methodology. Enzyme Microb Tech, 2007, 41(5): 613?619.

[15] Macedo G, Fraga L. Production of cutinase by Fusarium oxysporum in solid-state fermentation using agroindustrial residues. Biotechnol, 2007, 131(2): 211?241.

[16] Davies KA, Lorono ID, Foster SJ, et al. Evidence for a role of cutinase in pathogenicity of Pyrenopeziza brassicae on brassicas. Physiol Mol Plan P, 2000, 57(2): 63?75.

[17] Li DH, Ashby AM, Johnstone K. Molecular evidence that the extracellular cutinase Pbc 1 is required for pathogenicity of Pyrenopeziza brassicae on oilseed rape. Mol Plant Microbe Interact, 2003, 16(6): 545?552.

[18] Liu YB, Wu GF, Gu LH. Enzymatic treatment of PET fabrics for improved hydrophilicity. China Textile Leader, 2008, (6): 96?98.劉延波, 吳桂芳, 顧榴紅. 使用生物酶法提高滌綸織物的親水性. 紡織導報, 2008, (6): 96?98.

[19] Chen S, Tong X, Woodard RW, et al. Identification and characterization of bacterial cutinase. J Biol Chem, 2008, 283(38): 25854?25862.

[20] Chen S, Su LQ, Billig S, et al. Biochemical charaterization of the cutinases from Thermonbifida. J Mol Catal B-Enzym, 2010, 63(3/4): 121?127.

[21] Li ZP, Zhang X, Xu B, et al. Expression of hBLyS in the E. coli cell density culture using lactose as an inducer. Chin J Process Eng, 2005, 5(4): 446?449.李兆鵬, 張栩, 徐斌, 等. 重組大腸桿菌高密度發(fā)酵中乳糖誘導表達 hBLyS. 過程工程學報, 2005, 5(4): 446?449.

[22] Lin F, Qin S. Lactose-induced expression of recombinant allophycocyanin in Escherichia coli JM109(DE3). Mat Sci, 2005, 29(11): 22?27.林凡, 秦松. 乳糖誘導重組別藻藍蛋白基因在大腸桿菌中的表達. 海洋科學, 2005, 29(11): 22?27.

[23] Li ZF, Li B, Liu ZG, et al. Calcium leads to further increase in glycine-enhanced extracellular secretion of recombinant α-cyclodextrin glycosyltransferase in Escherichia coli. J Agric Food Chem, 2009, 57(14): 6231?6237.

[24] Cheng J, Wu D, Chen S, et al. Effect of complex and synthetic medium on extracellular production of α-cyclodextrin glycosyltransferase in E. coli. China Biotechnol, 2010, 30(9): 36?42.程婧, 吳丹, 陳晟, 等. 復(fù)合與合成培養(yǎng)基對大腸桿菌胞外生產(chǎn) α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的影響. 中國生物工程雜志, 2010, 30(9): 36?42.

[25] Zhang HW, Wang L, Xu GR, et al. Fed-batch fermentation of ethanol from glycerol by mixed culture of microorganisms. Chin J Appl Environ Biol, 2008, 14(5): 678?683.張宏武, 王璐, 許贛榮, 等. 混合培養(yǎng)微生物利用甘油補料發(fā)酵生產(chǎn)乙醇研究. 應(yīng)用與環(huán)境生物學報, 2008, 14(5): 678?683.