陳爽，宋娜，廖學(xué)品，石碧,

1 四川大學(xué)生物質(zhì)化學(xué)與工程系，成都 610065

2 四川大學(xué) 制革清潔技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，成都 610065

過氧化氫酶 (Catalase，簡稱CAT，EC 1.11.1.6)是一種能高效催化過氧化氫轉(zhuǎn)化為水和氧氣的酶，存在于所有需氧微生物以及動(dòng)植物細(xì)胞內(nèi)。過氧化氫酶由4個(gè)亞基組成，F(xiàn)e(III)-原卟啉將這4個(gè)亞基連接成一條具有酶活性的多肽鏈[1]。

過氧化氫酶在食品、紡織、造紙、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、廢水處理等方面有著廣泛的應(yīng)用[2-6]。但由于自由酶穩(wěn)定性差，易受各種環(huán)境因素影響而失活、難以重復(fù)使用，反應(yīng)后產(chǎn)物的分離、純化以及酶的回收困難，導(dǎo)致生產(chǎn)成本提高，增加了產(chǎn)品污染的機(jī)會(huì)，限制了過氧化氫酶的工業(yè)應(yīng)用[7-9]。

固定化酶是通過物理的或化學(xué)的方法，將酶分子束縛在載體上，使其既保持酶的天然活性，又便于產(chǎn)物分離，可以重復(fù)使用。固定化酶有可回收、產(chǎn)物易分離、穩(wěn)定性高、利于實(shí)現(xiàn)連續(xù)反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，可以增加產(chǎn)物收率，提高產(chǎn)物質(zhì)量，使酶的使用效率提高，降低生產(chǎn)成本[10]。

在固定化酶技術(shù)中，載體材料對(duì)酶的性質(zhì)影響極大，合適的固定化載體材料是固定化酶是否成功的關(guān)鍵[11]。一些價(jià)廉易得的天然高分子如殼聚糖、海藻酸、淀粉等都是固定化酶的常用載體[12-13]。與其他固定化載體相比，上述天然高分子具有無毒、生物相容性好、價(jià)廉易得等優(yōu)點(diǎn)。研究表明，殼聚糖[14]和凝膠[15]等均可用于過氧化氫酶的固定。但是，這些天然高分子載體的水力學(xué)性質(zhì)較差，所以導(dǎo)致固定化酶難于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)。

膠原纖維也是一種天然高分子，為天然纖維結(jié)構(gòu)，不溶于水而又具有親水性。主要來自于動(dòng)物的皮。膠原纖維具有良好的生物相容性，對(duì)酶的親和性是其他載體材料所不能比擬的。它既有親水基團(tuán)又有疏水性基團(tuán)，這種兩親性質(zhì)使膠原纖維可以通過空間構(gòu)型的改變來適應(yīng)反應(yīng)體系中環(huán)境的變化，從而使酶的活性能夠充分發(fā)揮出來。此外，膠原分子肽鏈上具有多種功能基團(tuán)，如-COOH和-NH2等，不僅可以通過醛的交聯(lián)作用將酶互接固定在膠原纖維上，而且可以與金屬離子結(jié)合后再進(jìn)一步固定化酶。但是膠原纖維的熱穩(wěn)定性較差，本實(shí)驗(yàn)利用制革化學(xué)原理，用Fe(III) 對(duì)膠原纖維改性，目的是增加膠原纖維的熱穩(wěn)定性，同時(shí)可進(jìn)一步提高酶的載量。由于膠原纖維特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)，以膠原纖維為載體固定化酶不僅能很好的保持酶的活性，而且在固定床反應(yīng)器中具有較好的水力學(xué)特性，床層阻力較低。

首先用Fe(III) 對(duì)膠原纖維改性，主要是增加膠原纖維的熱穩(wěn)定性，然后通過戊二醛的交聯(lián)作用固定過氧化氫酶。研究了固定化酶的最適pH、最適溫度、熱穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性及貯存穩(wěn)定性并與未進(jìn)行固定化的自由酶進(jìn)行對(duì)比。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

膠原纖維 (按本課題組已建立的方法進(jìn)行制備)；牛肝過氧化氫酶 (EC.1.11.1.6，上?？笊锛夹g(shù)有限公司)。硫酸鐵、戊二醛、硫酸-甲酸溶液、無水乙醇、丙酮，碳酸氫鈉、考馬斯亮藍(lán)、30%的過氧化氫等試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 Fe(III) 改性膠原纖維的制備

較優(yōu)的制備條件是：2.000 g膠原纖維置于250 mL錐形瓶中，加入120 mL去離子水浸泡24 h，用甲酸-硫酸溶液調(diào)節(jié)溶液pH至1.8；加入0.204 g硫酸鐵，30 ℃下水浴振蕩反應(yīng)4 h。緩慢加入飽和碳酸氫鈉溶液，2~3 h內(nèi)將溶液pH升至4.0~4.5。45 ℃繼續(xù)反應(yīng)5 h，反應(yīng)結(jié)束后，過濾并用去離子水充分洗滌后經(jīng)乙醇、丙酮脫水，室溫下自然干燥，即得Fe(III) 改性膠原纖維 (Fe-CF)。

1.2.2 Fe-CF固定化過氧化氫酶

較優(yōu)的制備條件是：將 0.100 g Fe-CF置于16 mL濃度為0.030 g/mL的戊二醛溶液中，25 ℃水浴振蕩反應(yīng)1 h，過濾并用去離子水洗滌后加入到25 mL濃度為0.3 g/L的過氧化氫酶溶液中，25 ℃水浴振蕩反應(yīng)2 h；反應(yīng)結(jié)束后，過濾并用去離子水洗滌，即得到膠原纖維固定化過氧化氫酶(Fe-CF-Catalase)。

1.2.3 過氧化氫酶固載量的測定

考馬斯亮藍(lán)法[16]，通過測定固定前后溶液中過氧化氫酶的濃度來計(jì)算固載量。

1.2.4 固定化過氧化氫酶的酶活力、比酶活及酶活收率測定

酶活力定義：1個(gè)酶活力單位 (1 U) 規(guī)定為在25 ℃下，每分鐘分解1 μmol的過氧化氫所需的酶量。采用高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶的酶活力：1 mL濃度為0.300 g/L自由過氧化氫酶與5 mL濃度為100 mmol/L的過氧化氫溶液混合，25 ℃下保溫3 min，然后加入2 mL濃度為0.200 mmol/L的硫酸溶液終止反應(yīng)，反應(yīng)后殘留的過氧化氫用 100 mmol/L的高錳酸鉀溶液滴定。同時(shí)，以沸水滅活后的過氧化氫酶作為對(duì)照組。

同樣，0.100 g固定化酶與 10 mL濃度為100 mmol/L的過氧化氫溶液混合，25 ℃下保溫3 min，然后取出固定化酶，使反應(yīng)液與固定化酶分離，并測定反應(yīng)液的高錳酸鉀消耗量，并以等量的過氧化氫溶液的高錳酸鉀消耗量作為對(duì)照組。

過氧化氫酶的酶活計(jì)算公式為：

式中，S為過氧化氫酶的酶活力 (μmol/(mg·min))；A為對(duì)照組高錳酸鉀溶液的消耗量 (mL)；B為反應(yīng)組高錳酸鉀溶液的消耗量 (mL)；W為固載的過氧化氫酶量 (mg)；t為反應(yīng)時(shí)間 (min)；Cp為高錳酸鉀溶液的濃度；1.7為高錳酸鉀消耗量與過氧化氫量的計(jì)算系數(shù)；34為H2O2的分子量。

比酶活定義為每毫克酶蛋白所含的活力單位，則過氧化氫酶的比酶活計(jì)算公式為：

式中，N為過氧化氫酶的比酶活 (U/mg)，S為過氧化氫酶的酶活力 (U)；M 為過氧化氫酶的質(zhì)量(mg)。

酶活收率定義為固定化酶的總酶活力與其固定化前的總酶活力之比，則固定化過氧化氫酶的酶活收率計(jì)算公式為：

式中，P為固定化過氧化氫酶的酶活收率 (%)，S1為固定化過氧化氫酶的總酶活力 (U)，S2為過氧化氫酶固定化之前的總酶活力 (U)。

1.2.5 固定化過氧化氫酶與自由酶的最適溫度、最適pH、熱穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性及操作穩(wěn)定性

將固定化酶與自由酶置于15 ℃~75 ℃下，pH為7.0的檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液中保溫15 min后測定其酶活力，以確定最適反應(yīng)溫度。將固定化酶與自由酶于室溫下分別置于pH為3~8的檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液中15 min后測定其酶活力，以確定最適 pH值。將自由酶與固定化酶分別于不同溫度下 (15 ℃~75 ℃) 置于pH為7.0檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液，5 h后測定其酶活力，以測定熱穩(wěn)定性。分別考察固定化酶在pH為7.0的檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液中室溫貯存和在室溫下干燥貯存的穩(wěn)定性，每隔1天測試1次貯存試樣的酶活力，并與自由酶在pH為 7.0的檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液中貯存穩(wěn)定性對(duì)比。將0.100 g固定化過氧化氫酶與10 mL濃度為100 mmol/L的過氧化氫混合置于25 ℃的水浴中反應(yīng)3 min，然后取出固定化酶，同樣條件下重復(fù)試驗(yàn)，測定每次重復(fù)試驗(yàn)的相對(duì)酶活力，以測定固定化酶的操作穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化酶效果

通過考馬斯亮藍(lán)法測定，膠原纖維固定化過氧化氫酶的酶蛋白載量為16.7 mg/g，比酶活為1 050 U/mg。而自由過氧化氫酶的比酶活為3 000 U/mg，則固定化過氧化氫酶的酶活收率為35%。與自由過氧化氫酶相比，固定化過氧化氫酶的比酶活力有所下降，這可能是在固定化過程中，酶與載體相互作用使酶的活性中心或變構(gòu)中心的構(gòu)象發(fā)生變化或酶與底物間的相互作用受到空間位阻從而導(dǎo)致酶活力下降。我們知道，自由過氧化氫酶不能重復(fù)使用，且對(duì)使用溫度、pH等環(huán)境因素較為敏感，因此，以膠原纖維為載體制備的固定化過氧化氫酶若能提高過氧化氫酶的熱穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性，則有利于過氧化氫酶的實(shí)際應(yīng)用。在接下來的試驗(yàn)內(nèi)容中，我們著重研究了固定化酶的最適pH、最適溫度、熱穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性。

2.2 固定化酶的最適pH

由圖 1可見，固定化酶和自由酶的酶活力均隨著pH的改變而發(fā)生變化。自由酶與固定化酶的最適pH值均為 7.0。酶蛋白分子上帶有大量酸性和堿性氨基酸殘基，pH值的變化直接影響這些殘基側(cè)鏈基團(tuán)的解離狀態(tài)，進(jìn)而影響底物的結(jié)合和進(jìn)一步的催化反應(yīng)，使酶的活力發(fā)生變化[17-20]。在相同的 pH條件下，固定化酶的相對(duì)活力均高于自由酶，在pH為3時(shí)，固定化酶的相對(duì)活力為68%，而自由酶為45%；并且固定化酶的相對(duì)活力隨pH的變化的程度小于自由酶，在整個(gè)pH范圍內(nèi)，固定化酶的相對(duì)活力在68%以上，表現(xiàn)出了更廣的pH適應(yīng)范圍。說明膠原纖維對(duì)過氧化氫酶的固定較為穩(wěn)定，并可以降低外界pH變化對(duì)過氧化氫酶活力的影響。

圖1 自由酶及固定化酶的最適pHFig. 1 Optimal pH of free and immobilized catlase.

2.3 固定化酶最適溫度的測定

圖2表明，固定化酶和自由酶的酶活力都隨著溫度的改變而發(fā)生變化，自由酶及固定化酶的最適溫度均為25 ℃。但是，在相同的反應(yīng)溫度下固定化酶的相對(duì)活力均高于自由酶。在溫度為75 ℃時(shí)，固定化酶的相對(duì)活力為68.5%，而自由酶為46%。并且固定化酶的相對(duì)活力隨溫度的變化的程度也小于自由酶，在整個(gè)溫度范圍內(nèi)，固定化酶的相對(duì)活力在68.5%以上，溫度適應(yīng)范圍更寬。這表明過氧化氫酶經(jīng)固定化后對(duì)環(huán)境溫度的適應(yīng)性比自由酶更強(qiáng)。

圖2 自由酶及固定化酶的最適溫度Fig. 2 Optimal temperature of free and immobilized catlase.

2.4 固定化酶的熱穩(wěn)定性

圖3表明，自由酶和固定化酶的相對(duì)活力均隨著溫度的升高而降低，但在所考查的溫度范圍內(nèi)，固定化酶的相對(duì)活力均高于自由酶，這表明過氧化氫酶經(jīng)固定化后，其熱穩(wěn)定性提高。固定化酶在55 ℃下保溫5 h后，相對(duì)活力為58%，而自由酶相對(duì)活力僅為38%；而當(dāng)在75 ℃下保溫5 h后，固定化酶仍保留了30%的活力，而自由酶則完全失活。Cetinus等[21]采用吸附法將過氧化氫酶固定在殼聚糖上，在55 ℃保溫5 h后相對(duì)活力為50%?？梢?，膠原纖維作為載體固定過氧化氫酶具有較好的熱穩(wěn)定性。

圖3 自由酶及固定化酶的熱穩(wěn)定性Fig. 3 Thermal stability of free and immobilized catlase.

2.5 固定化酶的貯存穩(wěn)定性

如圖 4所示，固定化酶和自由酶的相對(duì)活力均隨著貯存時(shí)間的延長而降低。在相同的貯存時(shí)間下，固定化酶的相對(duì)活力均高于自由酶，而干燥貯存的固定化酶相對(duì)活力最高。在第 8天時(shí)，干燥貯存的固定化酶相對(duì)活力為91%，緩沖液中貯存的固定化酶相對(duì)活力為59%，而自由酶的相對(duì)活力僅為20%。這說明干燥狀態(tài)下和緩沖液中的固定化酶的貯存穩(wěn)定性均優(yōu)于緩沖液中的自由酶。12 d后，緩沖液中貯存的自由酶已經(jīng)失活，干燥狀態(tài)下和緩沖液中貯存的固定化酶的相對(duì)活力仍分別為88%及51%。將干燥狀態(tài)下的固定化酶繼續(xù)貯存至30 d時(shí)，固定化酶的相對(duì)活力為51%，顯示了該固定化酶良好的貯存穩(wěn)定性。

圖4 自由酶與固定化酶的貯存穩(wěn)定性Fig. 4 Storage stability of free and immobilized catlase.

2.6 固定化酶的操作穩(wěn)定性

酶在連續(xù)反應(yīng)時(shí)的穩(wěn)定性是決定固定化酶能否在工業(yè)上應(yīng)用的重要因素。與自由酶不同，固定化酶可以多次重復(fù)使用。

圖5表明，固定化酶重復(fù)使用6次后，酶活力沒有明顯下降，相對(duì)活力在95%以上。連續(xù)重復(fù)使用10次后，固定化酶的相對(duì)活力保持在87.3%，而連續(xù)重復(fù)使用26次后，固定化酶的相對(duì)活力仍保持在57.2%。謝雪鳳等[22]采用吸附法將過氧化氫酶固定在AB-8大孔樹脂上，當(dāng)重復(fù)使用10次后，相對(duì)活力為60%。這說明過氧化氫酶經(jīng)膠原纖維固定化后具有良好的操作穩(wěn)定性。

圖5 固定化酶操作穩(wěn)定性Fig. 5 Operational stability of immobilized catlase.

3 結(jié)論

Fe(III) 改性膠原纖維可作為固定化酶的載體，過氧化氫酶經(jīng)固定化后具有較好的熱穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性。固定化酶的使用pH和溫度范圍明顯提高。與其他天然高分子載體相比，F(xiàn)e(III)改性膠原纖維為載體固定過氧化氫酶具有更好的熱穩(wěn)定性及操作穩(wěn)定性。鑒于膠原纖維的特殊物理化學(xué)性質(zhì)，有望作為通用載體固定其他種類的酶。

REFERENCES

[1] Liu LZ, Zhong GR, Xiong L, et al. Research and application progress of catalase. Chem Bioeng, 2009, 26(3): 15?18.劉靈芝, 鐘廣蓉, 熊蓮, 等. 過氧化氫酶的研究與應(yīng)用新進(jìn)展. 化學(xué)與生物工程, 2009, 26(3): 15?18.

[2] Chu HD, Leeder JG, Gilbert SG.. Immobilized catalase reactor for use in peroxide sterilization of dairy products. Food Sci, 1975, 40(3): 641?643.

[3] Zhang KS, Tian HL. Research and function of catalae in organism. Food Sci Technol, 2007, 32(1): 8?11.張坤生, 田薈琳. 過氧化氫酶的功能及研究. 食品科技, 2007, 32(1): 8?11.

[4] Friess W. Collagen-biomaterial for drug delivery. Eur J Pharm Biopharm, 1998, 45(2): 113?136.

[5] Paar A, Costa S, Tzanov T, et al. Thermo-alkali-stable catalases from newly isolated Bacillus sp. for the treatment and recycling of textile bleaching effluents. J Biotechnol, 2001, 89(2/3): 147?153.

[6] Singh S, Melo JS, Eapen S, et al. Phenol removal using Brassica juncea hairy roots: role of inherent peroxidase and H2O2. J Biotechnol, 2006, 123(1): 43?49.

[7] Hu WJ, Tan TW, Wang F, et al. Immobilization of lipase by chemical modified of chitosan. Chin J Biotech, 2007, 23(4): 667?671.胡文靜, 譚天偉, 王芳, 等. 改性殼聚糖固定化脂肪酶的研究. 生物工程學(xué)報(bào), 2007, 23(4): 667?671.

[8] Li W, Sun JZ，Zhou QY. Advance in studies on polymer carriers for enzymes entrapment. J Funct Polym, 2001, 14(3): 365?369.李偉, 孫建中, 周其云. 適于酶包埋的高分子載體材料研究進(jìn)展. 功能高分子學(xué)報(bào), 2001, 14(3): 365?369.

[9] Vandamme EJ. Peptide antibiotic production through immobilized biocatalyst technology. Enzyme Microb Technol, 1983, 5(6): 403?416.

[10] Krajewska B. Application of chitin and chitosan-based materials for enzyme immobilizations: a review. Enzyme Microb Technol, 2004, 35(2/3): 126?139.

[11] Tweddell RJ, Kermasha S, Combes D, et al. Immobilization of lipase from rhizopus niveus: a way to enhance its synthetic activity in organic solvent. Biocatal Biotrans, 1999, 16(6): 411?426.

[12] Li GY, Yang DL, Jiang YR, et al. Immobilization Saccharomyces cerevisiae alcohol dehydrogenase on cross-linked calcium alginate beads. J Central South Univ: Sci Technol, 2009, 40(6): 1510?1516.李桂銀, 楊棟梁, 蔣玉仁, 等. 交聯(lián)海藻酸鈣凝膠固定化酵母醇脫氫酶研究. 中南大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2009, 40(6): 1510?1516.

[13] Chang MY, Juang RS. Activities, stabilities, and reaction kinetics of three free and chitosan–clay composite immobilized enzymes. Enzyme Microb Technol, 2005, 36(1): 75–82.

[14] ?etinus ?A, ?ztop HN. Immobilization of catalase into chemically crosslinked chitosan beads. Enzyme Microb Technol, 2003, 32(7): 889–894.

[15] Jürgen-Lohmann DL, Legge RL. Immobilization of bovine catalase in sol-gels. Enzyme Microb Technol, 2006, 39(4): 626?633.

[16] Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976, 72(1/2): 248?254.

[17] Pan LH, Luo JP, Jiang ST. Study on isoflavone active aglycone preparation by immobilized β-glucosidase from Aspergillus niger. Chin J Biotech, 2007, 23(6): 1060?1064.潘利華, 羅建平, 姜紹通. 固定化黑曲霉β-葡萄糖苷酶制備染料木素活性苷元的研究. 生物工程學(xué)報(bào), 2007, 23(6): 1060?1064.

[18] Cheng FL, Chen LL, Wang W, et al. Immobilization and stabilization of papain on SiO2particles containing amine groups. Chin J Biotech, 2004, 20(2): 287?290.程凡亮, 陳伶利, 王衛(wèi), 等. 氨基化二氧化硅顆粒固定木瓜蛋白酶研究. 生物工程學(xué)報(bào), 2004, 20(2): 287?290.

[19] Peng Q, Hou B, Yao F, et al. Influence of pH, temperature and concentration of substrate on the activity of L1 metallo-β-lactamase. Chin J Antibiot. 2010, 35(1): 69?71.彭青, 侯冰, 姚芬, 等. pH值、溫度、底物濃度對(duì)Ll型金屬β-內(nèi)酰胺酶活性的影響. 中國抗生素雜志, 2010, 35(1): 69?71.

[20] Liu Y, Gao H, Fan TT. Activity study on β-glucosidase immobilized on chitosan crosslinked with glutaraldehyde. Food Sci, 2008, 29(5): 315?318.劉穎, 高晗, 范婷婷. 殼聚糖-戊二醛交聯(lián)吸附法固定β-葡萄糖苷酶的研究. 食品科學(xué), 2008, 29(5): 315?318.

[21] ?etinus ?A, ?ahin E, Saraydin D. Preparation of Cu(II) adsorbed chitosan beads for catalase immobilization. Food Chem, 2009, 114(3): 962?969.

[22] Xie XF, Zhang ZH, Chen PC. Study on the immobilization of catalase by AB-8 M acroporous absorbent resin. Mater Rev, 2009, 23(18): 50?53.謝雪鳳, 張朝暉, 陳培策. AB-8大孔吸附樹脂固定化過氧化氫酶的研究. 材料導(dǎo)報(bào), 2009, 23(18): 50?53.