方 慶 陳新生

（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安慶醫(yī)院神經(jīng)外科，安徽 安慶 246003）

神經(jīng)干細(xì)胞相關(guān)研究進(jìn)展

方 慶 陳新生

（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安慶醫(yī)院神經(jīng)外科，安徽 安慶 246003）

神經(jīng)干細(xì)胞

1992年Reynolds等首次報(bào)道了從成鼠腦紋狀體中分離出能夠在體外增值并且具有向神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞分化潛能的神經(jīng)干細(xì)胞。近年來(lái)，神經(jīng)干細(xì)胞的研究及應(yīng)用對(duì)目前迅速發(fā)展的生命科學(xué)產(chǎn)生了巨大的影響，神經(jīng)干細(xì)胞能夠促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的再生及腦組織的修復(fù)，并且可以應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)的基因治療，表達(dá)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、代謝酶及神經(jīng)遞質(zhì)，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了新的有效途徑。本文就神經(jīng)干細(xì)胞的最新研究進(jìn)展和應(yīng)用作一綜述。

1 神經(jīng)干細(xì)胞的概念

神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）是干細(xì)胞的一種，是存在于腦和脊髓中的未分化細(xì)胞，同其他干細(xì)胞一樣，神經(jīng)干細(xì)胞也具有分裂增殖和多樣分化的特點(diǎn)，具有自我更新能力，它能夠分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等多種類型的神經(jīng)組織細(xì)胞，它屬于專能干細(xì)胞。1989年Anderson等首次提出了神經(jīng)干細(xì)胞的概念，隨后Reynolds和Cattaneo等分別報(bào)道了NSC的發(fā)現(xiàn)及NSC的特性。2000年Gage[1]將神經(jīng)干細(xì)胞概括為可生成神經(jīng)組織或者來(lái)源于神經(jīng)系統(tǒng)的具有自我更新能力并且能夠通過(guò)不對(duì)稱細(xì)胞分裂產(chǎn)生的新細(xì)胞。

2 神經(jīng)干細(xì)胞的來(lái)源及分布

2.1 胚胎神經(jīng)干細(xì)胞

中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)源于囊胚期內(nèi)細(xì)胞群，至少分為神經(jīng)球干細(xì)胞和神經(jīng)上皮干細(xì)胞兩類，前者依賴于表皮生長(zhǎng)因子（EGF）發(fā)育分化，后者依賴于成纖維生長(zhǎng)因子（FGF）發(fā)育分化[2]。1981年Evans等首次在實(shí)驗(yàn)中從小鼠囊胚中得到了第1個(gè)哺乳動(dòng)物來(lái)源的胚胎神經(jīng)干細(xì)胞。Thomson等[3]在1998年從體外受精的多余囊胚中建立了人胚胎神經(jīng)干細(xì)胞系。哺乳動(dòng)物的胚胎腦中神經(jīng)干細(xì)胞主要分布于以下7個(gè)部位：腦室下帶、海馬、嗅球、脊髓、小腦、側(cè)腦室腦（室管膜上皮）和大腦皮質(zhì)。研究認(rèn)為不同部位的神經(jīng)干細(xì)胞可能分別屬于不同的干細(xì)胞群體，并非同一類干細(xì)胞分布在不同的位置，所以腦的正常發(fā)育不僅取決胚胎神經(jīng)干細(xì)胞增值與分化，而且還取決于胚胎神經(jīng)干細(xì)胞哪些細(xì)胞會(huì)發(fā)生程序性死亡或者凋亡[4]。

2.2 成體神經(jīng)干細(xì)胞

成體神經(jīng)干細(xì)胞專指分布于胚胎、成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)及周圍神經(jīng)系統(tǒng)中干細(xì)胞。主要存在于腦室區(qū)、腦室下區(qū)、海馬、紋狀體、嗅球、脊髓等部位，在所有的成體哺乳動(dòng)物腦內(nèi)有兩個(gè)高密度的細(xì)胞分化區(qū)，即腦室下區(qū)和海馬齒狀回的粒下區(qū)。由于成體神經(jīng)干細(xì)胞可以來(lái)源患者本人，通過(guò)體外擴(kuò)增后再移植回患者本人的腦組織，所以可以避免免疫排斥，有可能解決限制神經(jīng)干細(xì)胞應(yīng)用的免疫排斥及倫理道德方面的難題[5]。但是由于從成人神經(jīng)系統(tǒng)提取成體神經(jīng)干細(xì)胞手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)高，此類細(xì)胞也存在于胎兒的腦中[6]，所以實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用中均是在利用流產(chǎn)胎兒的胎腦中提取成體神經(jīng)干細(xì)胞。田增民等[7,8]在研究中將取自于胎兒胎腦的成體神經(jīng)干細(xì)胞移植入小腦萎縮及帕金森癥的患者腦中取得良好的效果，患者神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙得到明顯改善。

2.3 間充質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞

由于間充質(zhì)細(xì)胞具有分化成為間質(zhì)起源的任意組織的潛能[9-12]，這使得間充質(zhì)干細(xì)胞成為神經(jīng)干細(xì)胞研究的一個(gè)新的熱點(diǎn)。由于間充質(zhì)干細(xì)胞取材范圍廣，并且可以取自自體組織，所以解決了免疫排斥和倫理道德的問(wèn)題，成為組織工程中的神經(jīng)干細(xì)胞的最佳選擇。間充質(zhì)干細(xì)胞分布廣泛，不僅存在于骨髓中，還可以從外周血、肌肉組織、牙齒組織、大腦及臍帶血、胎兒器官中分離得到[13,14]，并且有報(bào)道從臍帶靜脈內(nèi)皮下及羊水中也能分離得到間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞[15,16]。Jeong等[17]發(fā)現(xiàn)將從臍帶血中分離得到的間充質(zhì)干細(xì)胞在特定培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，能夠迅速分化成為神經(jīng)元細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。很多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)由間充質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞移植后能夠明顯改善神經(jīng)系統(tǒng)的功能[18]。Bliss等認(rèn)為間充質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞移植后改善神經(jīng)系統(tǒng)功能的機(jī)制可能是分泌出神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子增強(qiáng)神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)機(jī)制而不是替代損傷的神經(jīng)組織[19]。

3 神經(jīng)干細(xì)胞的生物學(xué)特性

神經(jīng)干細(xì)胞具有強(qiáng)大的增值分裂能力，它的主要生物學(xué)特性包括：①自我更新能力：神經(jīng)干細(xì)胞具有自我更新和高度增值的能力，一定的條件下能夠進(jìn)行有絲分裂。有絲分裂分為兩類即對(duì)稱分裂和不對(duì)稱分裂。②多分化潛能：神經(jīng)干細(xì)胞能夠分化成為神經(jīng)元細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞。③遷徙能力：在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程中，神經(jīng)干細(xì)胞不斷的進(jìn)行遷徙，并且受到病變部位神經(jīng)源性信號(hào)的影響，參與神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)。④良好的組織相容性：研究中發(fā)現(xiàn)移植的神經(jīng)干細(xì)胞能夠通過(guò)血腦屏障，在腦組織中與宿主細(xì)胞在結(jié)構(gòu)功能上形成良好的整合。⑤可以被轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定的表達(dá)外源性基因。⑥可以分離出單個(gè)細(xì)胞克隆。

4 神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定

4.1 神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)

目前多數(shù)神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)采用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞克隆技術(shù)進(jìn)行分離。在培養(yǎng)液中添加胰島素、黃體酮、腐胺、谷酰胺、轉(zhuǎn)鐵蛋白及具有絲裂原作用的生長(zhǎng)因子。神經(jīng)干細(xì)胞目前最基本的兩種培養(yǎng)方式是懸浮培養(yǎng)和單層貼壁培養(yǎng)，Reynold等大部分學(xué)者主要采用懸浮培養(yǎng)的方式來(lái)培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞。以此種方式培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞在培養(yǎng)基中以神經(jīng)球的方式生長(zhǎng)，有研究表明在瓊脂糖抗貼壁培養(yǎng)瓶中以懸浮培養(yǎng)的方式培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞有利于神經(jīng)干細(xì)胞的持續(xù)增殖，提示瓊脂糖抗貼壁培養(yǎng)適合神經(jīng)干細(xì)胞的大量擴(kuò)增[20]。但是此種方法培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的時(shí)候，隨著神經(jīng)球的增長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣滲入減少并且代謝廢物排除受阻，內(nèi)部較易出現(xiàn)凋亡、壞死，甚至出現(xiàn)神經(jīng)球中空的情況。Gage等[21]在研究中曾采用單層貼壁的方式培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，此種方法不存在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換困難的問(wèn)題，但是細(xì)胞只能向二維生長(zhǎng)，不能提供組織正常生長(zhǎng)發(fā)育所需要的環(huán)境條件，然而環(huán)境條件對(duì)細(xì)胞的基因表達(dá)和生物學(xué)行為起著相當(dāng)重要的作用，所以單層細(xì)胞培養(yǎng)所反映的生物學(xué)特性，與體內(nèi)組織細(xì)胞相差較大。近年來(lái)，很多研究者采用具有三維結(jié)構(gòu)的支架材料來(lái)進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)取得了良好的效果[22]，支架材料為細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支撐，提供與體內(nèi)組織更加相似的細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境，利于組織的生成[23]。

4.2 神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定

目前，對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定主要有形態(tài)觀察和標(biāo)志物檢測(cè)，但是最準(zhǔn)確的方法還是標(biāo)志物的檢測(cè)。光鏡下神經(jīng)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)有如下特點(diǎn)：①未分化的干細(xì)胞主要以兩種形式存在：一種是散在生長(zhǎng)分布的神經(jīng)干細(xì)胞，細(xì)胞大而圓且呈良好的活力狀態(tài)。另一種是形成神經(jīng)球的神經(jīng)干細(xì)胞，呈島嶼狀存活，邊緣清楚，表面光滑，結(jié)構(gòu)致密，隆起生長(zhǎng)，組成細(xì)胞球的細(xì)胞圓潤(rùn)飽滿呈較佳活力狀態(tài)。②不同部位來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞的生長(zhǎng)特性不同。③神經(jīng)干細(xì)胞的核型分析。目前神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志物檢測(cè)最常用的是神經(jīng)元中間絲蛋白，包括巢蛋白（nestin）和神經(jīng)元RNA結(jié)合蛋白Musashil。其次，角質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物（GFAP）、vimentin、CD133等也有應(yīng)用，另外神經(jīng)元NeuN、抗神經(jīng)元特異性標(biāo)記物β-tubulin-Ⅲ、5-溴-2-脫氧尿苷（BrdU）等也常用于神經(jīng)干細(xì)胞的熒光鑒定。

5 神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響因素

研究表明，神經(jīng)干細(xì)胞的分化由外源性因素（細(xì)胞因子）和內(nèi)源性因素（基因）共同調(diào)控，其中內(nèi)源性因素起著決定作用。

5.1 外源性因素

神經(jīng)干細(xì)胞分化的外源性因素主要包括：①生長(zhǎng)因子（如FGF2、EGF、BDNF、NT3、LIF等[24]），目前研究認(rèn)為堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF2）和表皮生長(zhǎng)因子（EGF）等在神經(jīng)干細(xì)胞的分化中起著最重要的作用，其他生長(zhǎng)因子主要起到協(xié)同作用；②微環(huán)境：包括神經(jīng)干細(xì)胞附近的神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)成分等。有研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)，神經(jīng)干細(xì)胞分化速度明顯加快，提示星形膠質(zhì)細(xì)胞可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞分化[25]。另外有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)許多神經(jīng)遞質(zhì)如甘氨酸、腎上腺素、GABA、乙酰膽堿等也參與神經(jīng)干細(xì)胞的分化的調(diào)節(jié)。

5.2 內(nèi)源性因素

研究表明，神經(jīng)干細(xì)胞分化的多樣性可能與轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)。不同的轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向不同的譜系分化。神經(jīng)干細(xì)胞的基因調(diào)控包括正性調(diào)節(jié)和負(fù)性調(diào)節(jié)。正性調(diào)節(jié)是通過(guò)不對(duì)稱分裂使神經(jīng)干細(xì)胞分化，其中bHLH轉(zhuǎn)錄因子包括NeuroD、Mash1和Math家族等[26]，bHLH基因主要調(diào)節(jié)神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的選擇，如錯(cuò)誤表達(dá)，可使分化的神經(jīng)元細(xì)胞減少，但是對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化無(wú)影響[27]。負(fù)性調(diào)節(jié)則是通過(guò)對(duì)稱性分裂增加神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量，但是使神經(jīng)干細(xì)胞不分化，主要包括Notch信號(hào)等途徑，與bHLH的作用相反，Notch的作用主要是抑制神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向膠質(zhì)細(xì)胞方向分化。

6 神經(jīng)干細(xì)胞的應(yīng)用研究

神經(jīng)干細(xì)胞的應(yīng)用目前已經(jīng)在神經(jīng)系統(tǒng)損傷、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、壞死性疾病等方面開(kāi)展了治療研究。目前神經(jīng)干細(xì)細(xì)的研究主要通過(guò)以下途徑：①將神經(jīng)干細(xì)胞體外擴(kuò)增移植到病損部位；②將生長(zhǎng)因子導(dǎo)入神經(jīng)干細(xì)胞，組織神經(jīng)細(xì)胞的變性壞死；③誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的激活、增殖來(lái)促進(jìn)損傷神經(jīng)的修復(fù)。Hideyuk等[28]在研究中將小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞移植入成鼠脊髓挫傷區(qū)后，小鼠的運(yùn)動(dòng)功能有所改善。田增民等[8]應(yīng)用人胚胎神經(jīng)干細(xì)胞植入帕金森患者的紋狀體，取得良好效果。

7 問(wèn)題與展望

神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為中樞神經(jīng)性的重建和神經(jīng)的再生提供了一個(gè)新的思路，打破了傳統(tǒng)觀念所認(rèn)為的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后不能再生，只能由星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，瘢痕組織代替缺失的神經(jīng)元。但是目前神經(jīng)干細(xì)胞的研究中還有很多問(wèn)題亟待解決，如定向誘導(dǎo)分化是目前神經(jīng)干細(xì)胞應(yīng)用于臨床的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題，我們還很難得到來(lái)源于同一譜系，分化程度一致，細(xì)胞無(wú)異質(zhì)性的神經(jīng)干細(xì)胞[29]；神經(jīng)干細(xì)胞移植后顯效慢，移植后患者腦內(nèi)瘤樣團(tuán)塊的形成，倫理上的爭(zhēng)議都是目前制約神經(jīng)干細(xì)胞臨床應(yīng)用的問(wèn)題。

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1671-8194（2011）08-0044-03