許星照 華飛 馮建國 談炎 劉瑤

·基礎(chǔ)研究·

腦紅蛋白在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)

許星照 華飛＊馮建國 談炎＊＊?jiǎng)?/p>

目的探討腦紅蛋白(NGB)在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)與分布。方法將SD大鼠隨機(jī)分為對照組和糖尿病組。糖尿病組大鼠采用鏈脲佐菌素一次性腹腔內(nèi)注射建立糖尿病模型。定期處死大鼠，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠視網(wǎng)膜組織中NGB的表達(dá)變化。結(jié)果糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的NGB分布逐漸增加后趨于穩(wěn)定。結(jié)論NGB在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜表達(dá)較對照組明顯增加，提示NGB可能在糖尿病狀態(tài)下為視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞供氧，減輕糖尿病視網(wǎng)膜缺氧造成的損害。(中國眼耳鼻喉科雜志，2011，11：90-91)

腦紅蛋白；糖尿病視網(wǎng)膜病變；免疫組織化學(xué)

腦紅蛋白(neuroglobin ，NGB)主要定位于脊椎動(dòng)物腦和視網(wǎng)膜中[1]，其功能還未完全確定。目前發(fā)現(xiàn)缺血低氧誘導(dǎo)NGB在神經(jīng)組織中表達(dá)增高，顯著提高神經(jīng)細(xì)胞抗缺氧的能力[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，常態(tài)下視網(wǎng)膜中NGB的含量是大腦中的100倍，占整個(gè)視網(wǎng)膜總蛋白量的2%～4%[3]。

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥，可導(dǎo)致不可逆的視力喪失。DR的原因可能是糖尿病狀態(tài)下局部血流減少，導(dǎo)致組織缺氧造成神經(jīng)細(xì)胞損害。本研究通過建立大鼠糖尿病模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測NGB在不同時(shí)間視網(wǎng)膜中的表達(dá)情況,探討NGB在糖尿病視網(wǎng)膜中的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 模型制備 40只SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分20只大鼠為實(shí)驗(yàn)組，20只為正常對照組。實(shí)驗(yàn)組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ，40 mg/kg體質(zhì)量)，對照組注射檸檬酸緩沖液(0.1 mol/L、pH=4.5)，注藥后72 h測血糖。實(shí)驗(yàn)組大鼠血糖均超過16.7 mmol/L，造模成功。將實(shí)驗(yàn)組大鼠隨機(jī)分為糖尿病2、4、6和 8周組，每組5只。分別于各時(shí)間點(diǎn)將對應(yīng)組動(dòng)物處死，取出眼球備用。

1.2 組織切片及蘇木素-伊紅(HE)染色 腹腔注射l%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，快速開胸；從左心室插管至升主動(dòng)脈，剪開右心耳；先用生理鹽水(約為動(dòng)物體重的35%)快速灌注，后續(xù)以含4%的多聚甲醛0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS，pH=7.4)；灌注量為生理鹽水的4倍；灌注結(jié)束后立即取出大鼠雙側(cè)眼球，去除眼前節(jié)投入固定液中，固定2 h；然后置入25%的蔗糖PBS中，4 ℃過夜至沉淀。最佳切削溫度(optimal cutting temperature,OCT)包埋劑包埋眼球，恒冷箱冷凍切片機(jī)-20 ℃連續(xù)矢狀切片。片厚8 μm，貼附于載玻片上，-80 ℃冰箱凍存，準(zhǔn)備進(jìn)行HE染色及免疫組織化學(xué)染色。

1.3 NGB染色及結(jié)果判定 免疫組織化學(xué)染色：切片取出后經(jīng)室溫平衡，用冷丙酮固定，晾干。PBS沖洗，0.3% H2O2室溫浸泡10 min；PBS沖洗，滴加NGB抗體，4 ℃過夜；PBS沖洗3次， 每次3 min，滴加二抗，室溫孵育1 h；PBS沖洗3次，每次3 min；二氨基聯(lián)苯胺顯色， 顯微鏡下控制染色強(qiáng)度。蘇木素復(fù)染，水洗后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。在200倍顯微鏡下觀察切片，視網(wǎng)膜NGB陽性表達(dá)物為棕黃色顆粒。

2 結(jié)果

2.1 血糖及HE染色 對照組大鼠血糖始終處于正常值范圍，實(shí)驗(yàn)組大鼠血糖在STZ誘發(fā)的第3 天起至實(shí)驗(yàn)結(jié)束均大于16.7 mmol/L。對照組大鼠體重逐漸增加；實(shí)驗(yàn)組大鼠在血糖增高后出現(xiàn)多飲、多食、多尿，體重?zé)o增加，部分明顯消瘦，出現(xiàn)個(gè)別大鼠死亡。

光鏡下正常對照組大鼠視網(wǎng)膜各層細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形態(tài)正常；實(shí)驗(yàn)組可見視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層水腫，細(xì)胞排列紊亂。

2.2 免疫組織化學(xué)檢測 正常對照組視網(wǎng)膜NGB主要表達(dá)于內(nèi)叢狀層、外叢狀層和光感受器內(nèi)節(jié)，在視網(wǎng)膜其他層很少表達(dá)(封三圖1)。在糖尿病誘導(dǎo)成功2周，視網(wǎng)膜組織中發(fā)現(xiàn)NGB陽性顆粒增加(封三圖2)；糖尿病4周時(shí)，NGB陽性顆粒明顯增加(封三圖3)；6周時(shí)，NGB陽性顆粒達(dá)到高峰(封三圖4)；8周時(shí)，趨于穩(wěn)定(封三圖5)。這些增加的陽性顆粒主要位于糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的內(nèi)叢狀層、外叢狀層和光感受器內(nèi)節(jié)，而在視網(wǎng)膜其他層很少表達(dá)。

3 討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病視網(wǎng)膜并發(fā)癥。高血糖使紅細(xì)胞攜氧能力減弱，使糖基化血紅蛋白在血紅蛋白中的比例增高，氧不易擴(kuò)散至組織中；使毛細(xì)血管基底膜增厚，從而引起視網(wǎng)膜組織慢性缺血缺氧，進(jìn)而造成組織損傷[4]。在2～4 周，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中即可發(fā)現(xiàn)局部血流減少[5]；眼局部應(yīng)用血管擴(kuò)張劑后可以減輕糖尿病視網(wǎng)膜病變表現(xiàn)，說明缺血缺氧在糖尿病視網(wǎng)膜損傷中的重要作用。

NGB在氧代謝方面有類似肌紅蛋白的功能，NGB和氧具有較高的親和力,儲(chǔ)存氧氣和促進(jìn)氧氣向線粒體擴(kuò)散或直接介導(dǎo)氧氣向線粒體傳遞，促進(jìn)ATP的產(chǎn)生，從而維持正常神經(jīng)元的功能[6]。正常大鼠視網(wǎng)膜中的NGB主要分布在內(nèi)叢狀層、外叢狀層和光感受器細(xì)胞內(nèi)節(jié)[3]，這3層是高耗氧層。在光感受器細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位顯示，NGB主要位于線粒體最集中的區(qū)域——頂部內(nèi)節(jié)的橢圓體區(qū)[7]，可見視網(wǎng)膜 NGB的分布和功能與線粒體耗氧有著直接或間接的聯(lián)系。有學(xué)者[2]發(fā)現(xiàn)NGB具有清除一氧化氮(NO)的功能， 參與NO的代謝過程，從而減少NO對線粒體的損傷，并且保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞來抵抗氧化應(yīng)激。最近，Rajendram和Rao[8]等通過免疫熒光和電鏡技術(shù)檢測末期青光眼患者的視網(wǎng)膜切片發(fā)現(xiàn)，患者視網(wǎng)膜的內(nèi)叢狀層、外叢狀層和光感受器內(nèi)節(jié)以及核層NGB表達(dá)增強(qiáng)，而在視網(wǎng)膜其他層很少表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)組大鼠視網(wǎng)膜組織中，NGB的表達(dá)高于對照組，表明糖尿病大鼠視網(wǎng)膜有缺血缺氧損傷，可誘導(dǎo)NGB表達(dá)升高。Sun等[2,9]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞低氧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與NGB基因表達(dá)的調(diào)控，低氧能使NGB基因表達(dá)增強(qiáng)。推測實(shí)驗(yàn)組糖尿病大鼠視網(wǎng)膜缺氧，細(xì)胞低氧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑處于激活狀態(tài)，NGB表達(dá)量隨著糖尿病的病程延長增多。我們認(rèn)為，NGB在缺氧狀態(tài)可能為視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞提供氧，減少氧化應(yīng)激，保護(hù)神經(jīng)元，減輕糖尿病視網(wǎng)膜缺氧造成的損害。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖尿病誘導(dǎo)2周視網(wǎng)膜組織中即發(fā)現(xiàn)NGB陽性顆粒少量增加，4周時(shí)明顯增加，8周時(shí)趨于穩(wěn)定。顯示隨著糖尿病病程延長，NGB陽性顆粒數(shù)量增加后趨于穩(wěn)定，提示在糖尿病視網(wǎng)膜病早期，視網(wǎng)膜可通過增加NGB的供氧來減輕視神經(jīng)細(xì)胞的損害；而在中后期，隨著糖尿病視網(wǎng)膜病變進(jìn)展，NGB的表達(dá)可能已經(jīng)飽和，不能有效減緩糖尿病視網(wǎng)膜病變的進(jìn)程。當(dāng)然，對于NGB在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的作用，尚值得進(jìn)一步探索。

[1]Burmester T,Weich B,Reinhardt S,et al.A vertebrate globin expressed in the brain[J].Nature,2000,407 (6803):520-523.

[2]Sun Y,Jin K,Mao XO,et al.Neuroglobin is up-regulated by and protects neurons from hypoxic-ischemic injury[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2001,98 (26):15306-15311.

[3]Schmidt M,Giessl A,Lauft T,et al.How does the eye breathe? Evidence for neuroglobin-mediated oxygen supply in the mammalian retina[J].J Biol Chem,2003,278 (3):1932-1935.

[4]Ciulla TA,Harris A,Latkany P,et al.Ocular perfusion abnormalities in diabetes[J].Acta Ophthalmol Scand,2002,80 (5):468-477.

[5]Mondal LK,Baidya KP,Bhattacharya B,et al.The efficacy of topical administration of brimonidine to reduce ischaemia in the very early stage of diabetic retinopathy in good controlled type-2 diabetes mellitus[J].J Indian Med Assoc,2004,102 (12):724-725,729.

[6]Geuens E,Brouns I,Flamez D,et al.A globin in the nucleus![J].J Biol Chem,2003,278 (33):30417-30420.

[7]李耀宇,劉惠玲,童繹，等.腦紅蛋白在大鼠眼球中分布的免疫組化學(xué)研究[J].眼科研究,2006,24 (5):461-464.

[8]Rajendram R,Rao NA.Neuroglobin in normal retina and retina from eyes with advanced glaucoma[J].Br J Ophthalmol,2007,91 (5):663-666.

[9]Sun Y,Jin K,Peel A,et al.Neuroglobin protects the brain from experimental stroke in vivo[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2003,100 (6):3497-3500.

2010-11-18)

(本文編輯 諸靜英)

Expressionofneuroglobininretinaofdiabeticrats

XUXing-zhao，HUAFei＊，F(xiàn)ENGJian-guo，TANYan＊＊，LIUYao.DepartmentofOphthalmology,AffiliatedThirdHospitalofSoochowUniversity，Changzhou213003，China

Corresponding author：Liu Yao,Email:jiahl2000@163.com

ObjectiveTo explore the neuroglobin ( NGB ) expression in retina of diabetic rats.MethodsThe SD rats were randomly divided into two groups：control group and diabetic group.Diabetes was induced by intraperitoneal injection of streptozotocin ( STZ ) in diabetic group．The immunohistochemical techniques were used to detect the expression of neuroglobin ( NGB ) in retina of each group at different time.ResultsThe expression of NGB increased gradually in retina of diabetic rats,then the tendency to be stable.ConclusionsA considerable increasing expression of NGB were found in diabetic group compared to control group.The study hints that NGB may supply oxygen to the retinal neurons at the condition of diabetes,and lessen the injury due to hypoxia in the diabetic retina.(Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2011,11:90-91)

Neuroglobin； Diabetic retinopathy； Immunohistochemistry

蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院眼科＊內(nèi)分泌科＊＊病理科常州 213003

劉瑤(Email：jiahl2000@163.com)