李學家，張秀娟，陳子亮，季 芳，彭白露，劉曉明

(廣東省昆蟲研究所華南靈長類研究開發(fā)中心，廣州 510555)

性成熟前食蟹猴生精細胞的發(fā)育進程

李學家，張秀娟，陳子亮，季 芳，彭白露，劉曉明

(廣東省昆蟲研究所華南靈長類研究開發(fā)中心，廣州 510555)

目的 闡明性成熟前食蟹猴生精細胞的發(fā)育進程。方法 分別采集性成熟前不同年齡(0歲、0.5歲、1歲、1.5歲、2歲、2.5歲、3歲、3.5歲、4歲)食蟹猴睪丸，制作石蠟切片，進行 HE染色和 PAS/H染色。根據(jù)生精細胞的染色特性，分析性成熟前食蟹猴生精細胞的發(fā)育進程，并對食蟹猴精原干細胞進行初步鑒定。結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示，1歲及以下食蟹猴生精上皮上生精細胞僅有精原干細胞(包括 Ad、At及 Ap型精原細胞)，1.5歲食蟹猴生精上皮上開始出現(xiàn)B型精原細胞，3歲食蟹猴生精上皮上出現(xiàn)精母細胞，4歲食蟹猴生精上皮上出現(xiàn)從精原干細胞到精子的所有生殖細胞。PAS/H染色結(jié)果顯示，1～2.5歲食蟹猴Ad型精原細胞胞質(zhì)呈PAS陽性，At型精原細胞胞質(zhì)呈PAS弱陽性，Ap型精原細胞胞質(zhì)呈PAS陰性;其他生精細胞及支持細胞胞質(zhì)呈陰性;0.5歲及以下，3歲及以上食蟹猴生精細胞的胞質(zhì)PAS/H染色特性與前者存在差異。結(jié)論 本文詳細闡述了性成熟前食蟹猴生精細胞隨年齡增長的漸次性發(fā)育模式，并建立了性成熟前食蟹猴精原干細胞原位鑒定的一種新方法，這些研究結(jié)果為食蟹猴精原干細胞的其他相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

食蟹猴;生精細胞;發(fā)育進程

青春期前男性睪丸內(nèi)生精細胞的發(fā)育進程是研究男性精子發(fā)生機制的重要基礎(chǔ)，也是精原干細胞(spermatogonial stem cells，SSCs)法治療放療性或化療性不育的前提之一。目前，在嚙齒類小型實驗動物，關(guān)于其性成熟前不同日齡生精細胞的發(fā)育進程已經(jīng)有詳細的研究報道［1］，由于嚙齒類動物從出生到性成熟的時間跨度較短，加之其在精原細胞組成、增殖及分化模型等諸多方面與人存在一定差異，因此，嚙齒類動物不是研究青春期前男性生精細胞發(fā)育的理想動物模型，因此，尋找一種理想的實驗動物模型來研究其性成熟前生精細胞發(fā)育進程，具有重要的理論意義和比較醫(yī)學價值。食蟹猴作為一種重要的實驗動物，與人的關(guān)系較為密切，其生精細胞組成、增殖及分化模式與人接近，是青春期前男性生精細胞發(fā)育進程研究的理想模型。目前，關(guān)于食蟹猴性成熟前不同時期生精細胞發(fā)育的研究報道較為零散，尚缺乏系統(tǒng)研究，原因可能是實驗材料昂貴、材料的系統(tǒng)收集較困難等。本研究利用本中心豐富的實驗動物資源，通過2年多時間對實驗材料進行了系統(tǒng)的收集和整理，制作了性成熟前不同年齡食蟹猴睪丸組織切片，并通過不同的染色方法對各級生精細胞進行鑒定，進而系統(tǒng)闡述了性成熟前食蟹猴生精細胞的發(fā)育進程，本研究的完成不但為食蟹猴食蟹猴SSCs的分離、純化、體外培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因等后續(xù)相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)，同時為人類的相關(guān)研究提供了重要的比較醫(yī)學參考資料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料：食蟹猴睪丸：1)疾病死亡猴(5只，年齡分別為1歲、2歲、2.5歲、3.5歲和4歲);2)意外死亡猴(2只，年齡分別為0歲和3歲);3)健康猴(2只，年齡分別為0.5歲和1.5歲)。三種猴采集睪丸時均須排除其患生殖系統(tǒng)疾病的可能性。處于節(jié)約實驗成本和動物福利考慮，盡量采集前兩種猴的睪丸。

1.1.2 主要藥品及試劑：鹽酸氯胺酮注射液購自山東方明藥物股份有限公司;多聚甲醛購自天津市福晨化學試劑廠;改良蘇木精染液、水溶性伊紅染液、糖原染色試劑盒購自廣州西比格貿(mào)易有限公司;磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無水乙醇、95%乙醇、二甲苯購自廣州化學試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 實驗猴年齡的選擇及選擇依據(jù)：食蟹猴性成熟年齡一般為3～4歲，因此，選擇以下9個年齡進行睪丸收集：0歲、0.5歲、1歲、1.5 歲、2歲、2.5歲、3歲、3.5歲、4歲。每個年齡的誤差允許范圍為 ±1個月。

1.2.2 睪丸的采集及準備：疾病或意外死亡幼年食蟹猴睪丸可直接采集，用4%多聚甲醛溶液4℃過夜固定后備用。幼年健康食蟹猴睪丸的采集方法為：1)鹽酸氯胺酮麻醉(10 mg/kg)動物;2)確定睪丸位置，進行局部消毒處理：3)在無菌條件下，剪開睪丸外側(cè)皮膚，拉出睪丸，并盡量分離周圍結(jié)締組織;4)摘除睪丸，并進行結(jié)扎止血，局部及全身應(yīng)用抗生素;5)睪丸稱重，然后置于4%多聚甲醛溶液4℃過夜固定后備用。

1.2.3 石蠟切片的制作：固定好的睪丸組織流水沖洗過夜，以完全除去固定劑，然后進行梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后進行切片，切片厚度為3～5 μm。具體操作步驟參照相關(guān)文獻［2］進行。

1.2.4 染色方法：本研究采用兩種不同的染色方法，一種是HE染色，此染色的目的是觀察食蟹猴睪丸中各種細胞的形態(tài)，具體操作步驟參照相關(guān)文獻［2］進行。另一種為 PAS/H(pexiodic acid-schiff/hematoxylin，PAS/H)染色，即過碘酸-雪夫染色(又稱糖原染色)，蘇木精復(fù)染細胞核。這一染色的目的是檢驗食蟹猴精原細胞胞質(zhì)的染色特征與人是否具有相似性，從而檢驗這一方法是否可以用于鑒定食蟹猴SSCs。具體操作步驟按照PAS/H染色試劑盒說明書進行。

1.2.5 組織學觀察及描述：對全部9個年齡段食蟹猴睪丸組織切片(包括HE染色切片和PAS/H染色切片)進行光鏡觀察，用尼康數(shù)碼成像系統(tǒng)對切片進行拍照，詳細分析性成熟前食蟹猴生精細胞的組織模式，并對各型精原細胞的形態(tài)學特征進行測量和系統(tǒng)描述。

1.2.6 生精細胞發(fā)育相關(guān)參數(shù)的測量方法：SSCs細胞核直徑的測量方法：光鏡下分別選擇HE染色切片中典型的Ad型、At型及 Ap型精原細胞各30個，分別進行細胞核直徑的測量。曲細精管直徑的測量方法及SSCs計數(shù)：光鏡下每個年齡食蟹猴的HE染色切片中隨機選取10個視野，對視野中的曲細精管橫斷面的直徑進行測量并對橫斷面上的SSCs計數(shù)。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析：所有數(shù)據(jù)以平均值 ±標準差(M±SD)表示。

2 結(jié)果

2.1 性成熟前食蟹猴精原細胞的形態(tài)學特征

光鏡下，性成熟前食蟹猴睪丸生精上皮上SSCs主要分為三類：A暗型精原細胞(Ad)、A過渡型精原細胞(At)及A亮型精原細胞(Ap)。在HE染色石蠟切片中，通過細胞核形態(tài)、大小及蘇木精染色特性可以將三類 SSCs區(qū)分開來。1)Ad型精原細胞：細胞核呈球形或卵圓形，直徑為 5.21±0.17 μm，細胞核著色深且均勻;2)At型精原細胞：細胞核呈卵圓形，直徑為5.96±0.21 μm，細胞核著色程度中等且均勻。3)Ap型精原細胞：細胞核呈卵圓形或橢圓形，直徑為6.90±0.17 μm，細胞核在三類SSCs中著色最淺且均勻。在1.5歲及以上食蟹猴睪丸中還可觀察到 B型精原細胞，細胞核呈卵圓形，細胞直徑約為7.32±0.14 μm，染色質(zhì)呈粗大顆粒狀或團塊狀，著色較深且在胞核中分布不均。

2.2 性成熟前食蟹猴睪丸石蠟切片H.E染色結(jié)果

新生食蟹猴睪丸曲細精管尚未形成管腔，管直徑為41.74±4.07 μm;睪丸間質(zhì)成分較多，約占視野下總面積的50%;管內(nèi)生精細胞為 SSCs(Ad、At及Ap)，數(shù)量較少，約50%靠近曲細精管基膜排布，另50%位于管中央，SSCs數(shù)量為0.85±0.59個/曲細精管橫斷面。

0.5 歲食蟹猴睪丸曲細精管亦未見管腔形成，管直徑為42.59±2.73 μm;睪丸間質(zhì)成分急劇減少，占視野下總面積的10%以下;管內(nèi)生精細胞組成無變化，絕大多數(shù)SSCs靠近曲細精管基膜排布，少數(shù)位于管中央，SSCs數(shù)量為0.90±0.85個/曲細精管橫斷面(彩插4圖A)。

1歲食蟹猴睪丸曲細精管僅有極少數(shù)形成狹窄管腔，管直徑為42.95±2.86 μm;睪丸間質(zhì)成分少;曲細精管中生精細胞組成及排布模式無明顯變化，SSCs數(shù)量略有增加，為1.60±0.73個/曲細精管橫斷面。

1.5 歲食蟹猴睪丸約80%曲細精管出現(xiàn)狹窄管腔，管直徑為43.66±2.19 μm;睪丸間質(zhì)成分少;曲細精管中生精細胞除SSCs外，出現(xiàn)少量 B型精原細胞;SSCs在曲細精管中的排布模式無明顯變化，而B型精原細胞一般位于SSCs上層近管腔側(cè)，SSCs數(shù)量略有增加，約為1.85±1.14個/曲細精管橫斷面(彩插4圖 B)。

2歲食蟹猴睪丸約80%曲細精管出現(xiàn)較為明顯的管腔，管直徑明顯增加，為53.94±1.91 μm;睪丸間質(zhì)成分少;曲細精管中SSCs及B型精原細胞的數(shù)量均明顯增加，但在曲細精管中的排布模式無明顯變化，SSCs數(shù)量為2.20±1.32個/曲細精管橫斷面(彩插4圖 C)。

2.5 歲食蟹猴睪丸曲細精管管腔發(fā)育情況與2歲相比無明顯變化，管直徑稍增加，為56.35±2.92 μm;睪丸間質(zhì)成分少;曲細精管中SSCs略有減少，為2.09±1.48個/曲細精管橫斷面，B型精原細胞分化程度增加(彩插4圖D)。

3歲食蟹猴睪丸曲細精管管腔進一步擴大，管直徑達60.52±1.78 μm;睪丸間質(zhì)成分少;曲細精管中SSCs數(shù)量與2.5歲比較變化不大，為2.17±1.26個/曲細精管橫斷面，B型精原細胞進一步分化，偶爾可在管腔中發(fā)現(xiàn)初級精母細胞，但數(shù)量較少。

3.5 歲食蟹猴睪丸曲細精管管腔繼續(xù)擴大，管直徑達68.77±2.50 μm;睪丸間質(zhì)成分少;曲細精管中SSCs數(shù)量略有增加，為2.50±1.26個/曲細精管橫斷面，部分曲細精管中出現(xiàn)處于不同分化階段的精母細胞(彩插4圖E)。

4歲食蟹猴睪丸曲細精管管腔急劇增加，管直徑達179.19±10.70 μm;睪丸間質(zhì)成分少;曲細精管中SSCs數(shù)量略有減少，為2.20±1.32個/曲細精管橫斷面;生精上皮上已經(jīng)出現(xiàn)從SSCs到精子的全部類型的生精細胞。但由于曲細精管不同位置發(fā)育時相的不同步，在某一曲細精管切面上只能看到某幾種而不是全部生精細胞(彩插4圖F)。

2.3 性成熟前食蟹猴睪丸石蠟切片PAS/H染色結(jié)果

睪丸組織切片 PAS/H染色結(jié)果顯示，0～0.5歲：Ad型精原細胞呈PAS弱陽性，Ap型精原細胞均呈PAS陰性(彩插4圖 G);1歲 ～2.5歲：Ad型精原細胞細胞質(zhì)呈 PAS陽性，At型精原細胞胞質(zhì)呈PAS弱陽性，Ap型精原細胞胞質(zhì)呈 PAS陰性，其他生精細胞及支持細胞胞質(zhì)呈PAS陰性(彩插4圖H～J)。3歲及以上：Ad及At型精原細胞胞質(zhì)呈PAS弱陽性或陰性，Ap型精原細胞胞質(zhì)呈PAS陰性，部分精子細胞的頂體呈 PAS陽性，其他細胞胞質(zhì)呈PAS陰性(彩插4圖K～L)。

3 討論

性成熟前非人靈長類動物生精細胞的發(fā)育進程對人類的相關(guān)研究具有重要的理論意義和比較醫(yī)學價值。Rey等［3］曾對性成熟前不同年齡黑帽懸猴睪丸生精小管進行組織學、形態(tài)度量學和功能學研究，從而揭示了黑帽懸猴是研究男性青春期睪丸發(fā)育的一個重要動物模型。Simorangkir等［4］在研究恒河猴A型精原細胞的增殖模式時，對新生期(1～2日齡)、嬰兒期(4～5月齡)及幼年期(14～17月齡)恒河猴進行了詳細的組織學研究。而作為重要實驗動物之一的食蟹猴，在生殖生理等方面與人具有很大的相似性，而其性成熟前睪丸發(fā)育的研究報道較為零散，缺乏系統(tǒng)的組織學研究報道。鑒于此，我們對性成熟前食蟹猴生精細胞的發(fā)育進程進行了系統(tǒng)的組織學研究，通過HE染色，詳細闡述了食蟹猴睪丸生精細胞的發(fā)育進程，通過 PAS/H染色，建立了性成熟前食蟹猴SSCs原位鑒定的一種新方法。本研究的完成不但為食蟹猴SSCs的體外相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)，對人類的相關(guān)研究也具有重要的比較醫(yī)學價值。

PAS/H染色法作為一種常規(guī)染色方法在非人靈長類動物睪丸生精上皮的組織學研究中被廣泛應(yīng)用［5～7］，但作為鑒定非人靈長類動物不同類型精原細胞的方法還未見文獻報道。PAS/H染色主要顯示細胞中的糖原類物質(zhì)，據(jù)文獻［8］報道，Ad型精原細胞胞質(zhì)中有糖原，為儲備型干細胞(reserve stem cells)，而Ap型精原細胞胞質(zhì)中無糖原，為增殖型干細胞(renewing stem cells)。有鑒于此，我們嘗試根據(jù)各型精原細胞的PAS/H染色特性，結(jié)合細胞核著色模式及在曲細精管中的空間排布模式，對食蟹猴SSCs進行原位鑒定。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，這一方法可鑒定2.5歲及以下食蟹猴睪丸中的SSCs(Ad/At/Ap型精原細胞)，尤其適合鑒定1～2.5歲食蟹猴睪丸中的Ad型精原細胞。對于性成熟前不同年齡食蟹猴SSCs PAS/H染色結(jié)果的差異，我們認為原因可能是：0.5歲及以下食蟹猴生精細胞發(fā)育緩慢，SSCs處于有絲分裂靜息狀態(tài)，因而呈 PAS弱陽性或陰性;從1歲開始，SSCs開始發(fā)育，并隨著年齡的增長，SSCs發(fā)育加快，Ad型精原細胞進入有絲分裂活躍狀態(tài)，因為表現(xiàn)出PAS陽性;3歲及以上食蟹猴中已經(jīng)出現(xiàn)大量B型精原細胞及部分精母細胞，生精細胞的增加主要來源于分化型生精細胞的有絲分裂，此時 SSCs的有絲分裂趨于緩慢，因而 Ad型精原細胞表現(xiàn)為PAS弱陽性或陰性，在4歲及成年食蟹猴睪丸中，精子細胞的頂體表現(xiàn)為 PAS陽性，與Dreef等［6］的報道相一致。因此，我們認為，PAS/H染色法作為2.5歲及以下食蟹猴SSCs免疫組化原位鑒定的輔助方法是完全可行和有效的。

SSCs在哺乳動物睪丸生殖細胞中所占的比例極小，據(jù)文獻報道，在成年小鼠的睪丸中，SSCs與全部生殖細胞的比例約為 2～3∶10000［9］。而在幼年動物，尤其是處于幼年某一特定發(fā)育階段的動物，其睪丸中生殖細胞主要是未分化型精原細胞，若在此階段進行SSCs分離及純化，可以有效地避免其他類型生殖細胞的混雜而獲得較高純度的SSCs。據(jù)文獻［10］報道，一般小鼠選擇生后7～8 d的，大鼠用生后9～10 d的，兔子用1個月以內(nèi)的，山羊用2月齡左右的，狗和牛用3月齡以內(nèi)的較為適宜。而在食蟹猴，還沒有關(guān)于SSCs最佳分離年齡的報道。在本研究中，我們通過對性成熟前不同年齡食蟹猴睪丸切片的詳細觀察和系統(tǒng)分析后發(fā)現(xiàn)，1～1.5歲食蟹猴睪丸中未分化型精原細胞的比例較大，而分化型生精細胞的比例較小，較適合進行SSCs的分離、純化及體外培養(yǎng)等相關(guān)研究。

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The Developmental Process of Spermatogenic Cells in Immature Cynomolgus Monkeys

LI Xue-jia，ZHANG Xiu-juan，CHEN Zi-liang，JI Fang，PENG Bai-lu，LIU Xiao-ming
(South-China Primate Research ＆ Development Center，Guangdong Entomological Institute，Guangzhou，510555，China)

Objective To elucidate the developmental process of spermatogenic cells in immature Cynomolgus monkey.Method Testis of 0，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4 years old Cynomolgus monkeys were collected，paraffin sections were made，stained with HE and PAS/H(pexiodic acid-schiff/hematoxylin，PAS/H).Based on the staining pattern，the developental process of spermatogenic cells in immature Cynomolgus monkey was analysed and spermatogonial stem cells were primarily identified.Result HE Staining showed spermato gonial stem cells(including dark type A spermatogonia，transitional type A spermatogonia and pale type A spermatogonia)were the only spermatogenic cells in seminiferous epithelium of Cynomolgus monkey at 1 year old and below，Type B spermatogonia emerged at 1.5 years old，spermatocyte emerged at 3 years old，and all types of spermatogenic cells(from spermatogonial stem cells to sperm)were present at 4 years old Cynomolgus monkey.PAS/H staining showed cytoplast of dark type A spermatogonia as positive，transitional type A spermatogonia as weakly positive，and pale type A spermatogonia as negative，while cytoplast of sertoli cells and other spermato genic cells as negative in Cynomolgus monkey between one year old and 2.5 years old.Cytoplast of spermatogenic cells have a different PAS/H staining pattern in Cynomolgus monkey at 6 months old and below，3 years old and above.Conclusion This article detailedly elucidated the progressive development model of spermatogenic cells with age and established a new method for in situ identification spermatogonial stem cells in immature Cynomolgus monkey.These results will lay the foundation of spermatogonial stem cells related research in Cynomolgus monkey.

Cynomolgus monkey;Spermatogonic cells;Developmental process

S185 R332

A

1671-7856(2011)03-0031-05

2010-08-06

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.03.008

廣東省科學院基金(styz2008)。

李學家(1980-)，男，助理研究員，研究方向：實驗動物學。

劉曉明(1960-)，男，副研究員。E-mial：xemoonliu@hotmail.com。