周開(kāi)國(guó)，何桂珍，董良廣，陳學(xué)峰，張 睿

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)院腸內(nèi)腸外營(yíng)養(yǎng)科，北京 100730)

建立大鼠持續(xù)性腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)的輸注模型和淋巴液引流方法

周開(kāi)國(guó)，何桂珍，董良廣，陳學(xué)峰，張 睿

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)院腸內(nèi)腸外營(yíng)養(yǎng)科，北京 100730)

目的 建立大鼠持續(xù)性腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)的輸注模型和淋巴液引流的方法。方法 大鼠行胃造口后游離硅膠管至背部，通過(guò)swivel管連接到微量輸液泵。5 d持續(xù)勻速的輸入腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)后開(kāi)腹并游離腸淋巴干，大鼠在腸道缺血60 min再灌注120 min同時(shí)潛行插入硅膠管收集淋巴液。結(jié)果 第一次胃造口術(shù)后大鼠持續(xù)腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)輸注通暢，未出現(xiàn)死亡或并發(fā)癥狀。第二次手術(shù)時(shí)通過(guò)較簡(jiǎn)單的方法可以獲取淋巴液，成功率較高，可達(dá)90%以上。結(jié)論大鼠持續(xù)腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)輸注模型的建立，為研究營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的作用搭建了一個(gè)平臺(tái);通過(guò)較簡(jiǎn)單的方法獲取淋巴液可以為研究淋巴液的成分提供便利。

大鼠;腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng);淋巴引流

腸內(nèi)腸外營(yíng)養(yǎng)從上世紀(jì)六十年代開(kāi)展以來(lái)，已經(jīng)在國(guó)內(nèi)外臨床中得到廣泛的應(yīng)用。隨著臨床應(yīng)用的普遍性，研究各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)作用的基礎(chǔ)研究也不斷深入。作為基礎(chǔ)研究的一個(gè)重要部分—?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)的腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)持續(xù)輸注模型的建立具有重要的作用。而大鼠淋巴液由于技術(shù)難度較高而難以獲得。本課題組建立了大鼠持續(xù)性輸入腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)的輸注模型，并在大鼠缺血再灌注同時(shí)建立較簡(jiǎn)單易行且成功率較高的腸淋巴液獲取方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD健康雄性大鼠16只，封閉群，體重(306±9.33)g，均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［合格證號(hào) SCXK(京)2007-0001］。所有大鼠均飼養(yǎng)于北京協(xié)和醫(yī)院動(dòng)物中心隔離屏障設(shè)施環(huán)境中，溫度18℃ ～29℃，相對(duì)濕度40% ～70%，噪聲≤60 dB，人工照明150～300 lx。全部大鼠均單籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d。

1.2 手術(shù)物品

剪刀、眼科剪、眼科鑷、有齒鑷、無(wú)齒鑷、持針器、縫針、5-0縫線、粗絲線、用于引流和輸注營(yíng)養(yǎng)液的硅膠導(dǎo)管(內(nèi)徑 ID0.8 mm，外徑 OD1.2 mm，濟(jì)南晨光醫(yī)用導(dǎo)管廠)、收集淋巴液的 Nunc凍存管(丹麥Nunc公司)、自制腹腔拉鉤、輸液用 Swivel旋轉(zhuǎn)軸裝置(instech laboratories，icn.USA，封底圖 1)，無(wú)菌操作包內(nèi)還應(yīng)準(zhǔn)備棉簽、紗布、自制老鼠洞巾和固定拉鉤的文具釘，每次手術(shù)前所有物品均需滅菌處理。

1.3 腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)輸注模型的建立

16只大鼠術(shù)前均禁食12 h，可自由飲水。稱(chēng)重后腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)。麻醉滿(mǎn)意后大鼠固定在自制手術(shù)木板上，腹部劍突下正中切口，長(zhǎng)約2.5 cm.進(jìn)腹找到胃，在胃底用5-0縫線做一荷包縫合。造口后插入硅膠管，硅膠管在插入前用粗絲線打一死結(jié)，插入深度為4～6 cm，收緊荷包，固定硅膠管。從管的另一端注入1.5 mL生理鹽水測(cè)試硅膠管是否通暢。硅膠管從腹腔穿出，皮下游離并從后背皮膚穿出，關(guān)閉腹腔。硅膠管通過(guò)Swivel旋轉(zhuǎn)軸裝置連接到微量輸液泵。把Swivel旋轉(zhuǎn)軸裝置固定在背部肌肉或脊柱上。術(shù)后約2 h大鼠蘇醒后，開(kāi)始給予營(yíng)養(yǎng)液(封底圖2)。營(yíng)養(yǎng)液的配制為等氮(1.8 g/kg·d) 、等熱量(250 kcal/kg·d)，所有營(yíng)養(yǎng)液在無(wú)菌操作的條件下配制。用微量注射泵24 h勻速輸注，輸注速率為2 mL/h，第一天給與半量。每次更換營(yíng)養(yǎng)液時(shí)用1 mL生理鹽水沖洗管道。大鼠可以在代謝籠中自由活動(dòng)，記錄術(shù)中和術(shù)后發(fā)生的不良反應(yīng)以及是否出現(xiàn)死亡現(xiàn)象、老鼠精神狀態(tài)和給予營(yíng)養(yǎng)5 d前后的體重。

1.4 淋巴液引流

16只大鼠持續(xù)在給予營(yíng)養(yǎng)液5 d后行第二次手術(shù)。開(kāi)腹前步驟和第一次手術(shù)相同，切口選擇偏下方長(zhǎng)度約3 cm，進(jìn)入腹腔后，用棉簽把腸道輕柔的撥向大鼠左側(cè)。在右腎動(dòng)脈水平可以找到腸系膜上動(dòng)脈。在其上方可以發(fā)現(xiàn)一根呈乳白色腸淋巴干。在近腹主動(dòng)脈處小心分離漿膜，鈍性分離腸系膜上動(dòng)脈及腸淋巴干。分離腸淋巴干后在近心端剪一小口，將導(dǎo)管一端剪成45°，緩慢斜向下輕送進(jìn)3～5 mm，然后用少量醫(yī)用膠(北京福愛(ài)樂(lè)科技發(fā)展有限公司)涂抹在插入口、右腎旁漿膜處以及腹腔切口右側(cè)固定導(dǎo)管，以防脫出。導(dǎo)管另一端插入預(yù)先已在管蓋鉆一小孔的Nunc管(封底圖3)。缺血再灌注是課題研究需要，因本課題組主要研究腸道缺血再灌注時(shí)淋巴液中生物活性物質(zhì)的變化及對(duì)遠(yuǎn)隔組織的影響。所以建立淋巴引流的方法。在硅膠管插入淋巴干后用無(wú)創(chuàng)血管夾夾住腸系膜上動(dòng)脈，夾閉60 min后松開(kāi)夾子復(fù)灌120 min。為防止松夾時(shí)出現(xiàn)一過(guò)性低容量反應(yīng)，所有大鼠在缺血再灌注過(guò)程中均在腹腔開(kāi)口處蓋上用生理鹽水濕潤(rùn)的無(wú)菌敷料(封底圖4)，間斷給與生理鹽水。記錄術(shù)中術(shù)后發(fā)生的不良反應(yīng)以及插管成功率和3 h引流量。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物觀察

第一次胃造口手術(shù)后，所有老鼠均未出現(xiàn)腹腔切口感染，腸粘連，出血等并發(fā)癥，未有死亡現(xiàn)象。給與營(yíng)養(yǎng)后精神狀態(tài)良好，腹部后背體毛逐漸長(zhǎng)出，傷口愈合佳。持續(xù)5 d連續(xù)營(yíng)養(yǎng)液輸液后體重較前有不同程度上升。

2.2 淋巴液引流

在大鼠腸道缺血再灌注同時(shí)采用較簡(jiǎn)單易行的淋巴液獲取方法。在熟練掌握獲取方法后，淋巴引流的成功率較高(15/16，93.8%)，3 h淋巴引流量為0.6～1.0 mL。引流的淋巴液進(jìn)一步測(cè)定其內(nèi)毒素和炎性因子的濃度，并與正常大鼠進(jìn)行對(duì)照。

3 討論

大鼠的腸道特征(解剖、代謝甚至生化)與人的相似［1］，并且大鼠腸道對(duì)脂溶性物質(zhì)的吸收也與人相似［2］。所以大鼠是作為營(yíng)養(yǎng)研究的理想動(dòng)物。目前認(rèn)為腸道是多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS) 的發(fā)動(dòng)機(jī)［3］，其可能是獨(dú)立的腸源性的因子經(jīng)“腸—淋巴”途徑到達(dá)系統(tǒng)循環(huán)導(dǎo)致系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(systemicinflammatory response syndrome，SIRS)和遠(yuǎn)隔組織器官損進(jìn)而引起 MODS［4］，因?yàn)榱馨褪且粋€(gè)重要途徑，淋巴引流研究其成分是一個(gè)重要的研究手段。但以往的淋巴引流多集中在胸導(dǎo)管，且操作復(fù)雜，解剖難度大，一些顯微操作器械不是每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都可以具備，所以建立相對(duì)簡(jiǎn)單的腸道淋巴液引流方法對(duì)研究淋巴液中成分是必需的。

動(dòng)物手術(shù)時(shí)要嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作的步驟。腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)輸注模型建立中應(yīng)該注意：①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)安全麻醉，術(shù)后能及時(shí)清醒。②胃造口時(shí)硅膠管插入前用粗絲線打的結(jié)不能太緊也不能太松，太緊則輸注營(yíng)養(yǎng)液困難，太松則不能起到增大摩擦的作用，插管容易從造口中滑出。③管插入深度原則上是寧長(zhǎng)勿短，短容易滑出造口。④因?yàn)榇笫笃つw比較松弛，要保證大鼠能在代謝籠中自由活動(dòng)，所以Swivel旋轉(zhuǎn)軸裝置應(yīng)該固定在肌肉或脊柱上。⑤每次更換營(yíng)養(yǎng)液時(shí)應(yīng)用注射器輸注1 mL生理鹽水做通管用以防堵塞。⑥輸注營(yíng)養(yǎng)液出現(xiàn)堵塞現(xiàn)象時(shí)可以用10 mL注射器高壓通管。

淋巴液引流時(shí)應(yīng)該注意：①鈍性分離腸系膜上動(dòng)脈及腸淋巴干漿膜時(shí)必須操作仔細(xì)，不需要完全分離腸系膜上動(dòng)脈及腸淋巴干。有研究報(bào)道完全分離與不完全分離對(duì)插管成功率沒(méi)有差別［5］。②腸系膜淋巴管位置相對(duì)表淺，管壁特別薄，僅由多層上皮細(xì)胞組成，很容易撕裂。游離一小段即可。③剪口盡量選擇在近心端，因?yàn)槿绻亩瞬迦胧?，還有遠(yuǎn)心端可以選擇。④腸淋巴管的位置多與腸系膜上動(dòng)脈平行在其上側(cè)，但是騎跨的情況并不少見(jiàn)，甚至還可以在腸系膜上動(dòng)脈后方，與彭等的報(bào)道一致［6］。⑤插入的硅膠管應(yīng)與淋巴管成平行，所以固定硅膠管時(shí)應(yīng)有此概念。

本實(shí)驗(yàn)插管成功率較以往報(bào)道稍高，可能由于插管難度不一，以致影響插管質(zhì)量而導(dǎo)致的差異，也有大鼠之間個(gè)體差異的原因。本方法所需器材相對(duì)簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)室容易添置。所需人力要求不高，一人足以完成。這是此方法優(yōu)勢(shì)所在。

飲食對(duì)淋巴液的流量有明顯影響，禁食超過(guò)4 h時(shí)會(huì)影響淋巴的量，而本實(shí)驗(yàn)因完全按照臨床手術(shù)規(guī)范行事，禁食時(shí)間較長(zhǎng)，這影響淋巴液的引流量。相比國(guó)內(nèi)外報(bào)道的淋巴引流量偏少。國(guó)外 Boyd［7］報(bào)道的淋巴液引流量較大，可能與其術(shù)前1 h應(yīng)用1.5～2 mL橄欖油，術(shù)中輸液有關(guān)。還與其是從胸導(dǎo)管引流淋巴液有關(guān)，因?yàn)樾貙?dǎo)管的淋巴淋量占全身的50% ～70%，而本實(shí)驗(yàn)采用的是腸淋巴干引流。

目前隨著醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究的范圍越來(lái)越廣，研究深度也在不斷加深。持續(xù)腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)輸注模型的建立和淋巴液獲取方法的簡(jiǎn)便化可以為研究疾病與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的作用機(jī)制提供一個(gè)良好的技術(shù)平臺(tái)。

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Model Establishment of Continuous Infusion of Enteral Nutrition and a Method for Obtaining Lymph in Rats

ZHOU Kai-guo，HE Gui-zhen，DONG Liang-guang，CHEN Xue-feng，ZHANG Rui
(Department of Enteral and Parenteral Nutrition，PUMC Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100730，China)

Objective To establish model of continuous infusion of enteral nutrition and a method for obtaining lymph in rats.Method After rats received gastrostomy，the silicone tube，which freed to post back，was connected to the micro infusion pump through the swivel.After 5 days of continuous enteral nutrition the rats were opened the abdominal cavity and freed the intestinal lymph trunk，then the rats was subjected to intestinal ischemia for 60 minutes and reperfusion for 120 minutes，meanwhile，stealth inserted the silicon tube to collect lymph.Result After the first operation，the continuous infusion of enteral nutrition was smooth in rats and there were no death or complications symptoms.The lymph fluid was obtained by a simpler method，which success rate was higher than 90%in the second operation.Conclusion Model establishment of continuous infusion of enteral nutrition in rats could greatly facilitate to study the role of nutrients.The simple method to obtain the lymph provides greatly convenience for the study of lymph ingredients.

Rats;Enteral nutrition;Lymphatic drainage

R332

A

1671-756(2011)03-0049-03

2010-06-22

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.03.012

國(guó)家自然基金資助項(xiàng)目(30940069)。

周開(kāi)國(guó)(1985-)，男，研究生。

何桂珍 ，教授，研究生導(dǎo)師，研究方向：臨床營(yíng)養(yǎng)。E-mail：hgzpumc@163.com。