王 偉,羅泰來,柏銀蘭

2.第四軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)教研室,西安 710032

噬菌體技術(shù)用于結(jié)核病診斷的研究進(jìn)展*

王 偉1,羅泰來2,柏銀蘭2

2.第四軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)教研室,西安 710032

結(jié)核病是一種主要由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)——少數(shù)為牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌感染而引發(fā)的危害嚴(yán)重的傳染病。據(jù)WHO統(tǒng)計,全球約1/3的人口感染MTB,每年新增患者900萬,并有300萬人死于該病。因此,盡早、及時地診斷出結(jié)核患者,不僅能及時治療結(jié)核患者,也有利于結(jié)核病的控制。目前,結(jié)核病診斷主要依靠實驗室診斷、影像診斷以及臨床體癥相結(jié)合的方法,實驗室診斷主要包括抗酸染色涂片法、培養(yǎng)法,另外還有血清學(xué)診斷方法[1]和分子生物學(xué)診斷等方法[2]。但是這些方法的檢測特異性不高,難以區(qū)分MTB潛伏感染和非結(jié)核分枝桿菌感染[3],且報告時間難以滿足臨床快速診斷的需要[4]。噬菌體技術(shù)用于MTB的研究已有50多年歷史。近年來,大量研究發(fā)現(xiàn)噬菌體可以用于MTB鑒定及細(xì)菌藥物敏感性測定,由于噬菌體檢測M TB具有報告時間短、特異性較高等特點,因而在早期診斷方面引起研究者的廣泛關(guān)注。

1 噬菌體檢測 噬菌體是一類細(xì)菌病毒,分為毒性噬菌體及溫和噬菌體。前者可在敏感宿主菌內(nèi)增殖,并使之裂解;后者基因組整合于宿主基因組中,成為細(xì)菌DNA的一部分,不單獨復(fù)制。噬菌體由于與宿主菌的關(guān)系具有高度特異性,因此常用于細(xì)菌分型、轉(zhuǎn)導(dǎo),也可以利用基因重組技術(shù)構(gòu)建熒光報告噬菌體[4-5]。噬菌體生長快、侵染特異性高,最快的檢測可以在24 h內(nèi)觀察到明顯的結(jié)果,平均檢測時間為2 d[4]。而MTB檢測“金標(biāo)準(zhǔn)”細(xì)菌培養(yǎng)法檢測需要至少8 w的時間,因此噬菌體檢測技術(shù)具有快速、廉價、操作簡便、技術(shù)要求低的優(yōu)點,其總準(zhǔn)確度可以達(dá)到 80%以上,且很少出現(xiàn)假陽性結(jié)果[6]。

2 分枝桿菌噬菌體株 用于MTB研究的新發(fā)現(xiàn)和新人工構(gòu)建分枝桿菌噬菌體株很多,毒性噬菌體株有 TM4、D29、DS6A 、I3,其中 TM4 和 D29 較為常用,侵染效果較好;溫和噬菌體株有 L1、L5等,主要用于構(gòu)建熒光報告噬菌體[11]。常見的熒光報告噬菌體中,phAE40是第一代由TM4衍生出的毒性熒光報告噬菌體,其檢測敏感性較高,能檢測出104/mL的活細(xì)菌[5];phGS18基因型與L5同源,對恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)具有更高的敏感性,但很少用于侵染MTB[8];phBD8由D29衍生,使用較少。

3 噬菌體擴(kuò)增裂解法及其檢測 噬菌體擴(kuò)增裂解法(phage amplified biologically assay,PhaB)首次由Wilson[5]等提出,其原理是利用空斑形成實驗檢測MTB。噬菌體侵染細(xì)菌后在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖,最終裂解細(xì)胞,若觀察到噬菌斑則說明噬菌體已經(jīng)侵染了細(xì)胞,表明標(biāo)本中存在MTB。

檢測方法:采集患者標(biāo)本如痰液、尿、腦脊液、胸水、腹水,將標(biāo)本進(jìn)行去污染和殺滅雜菌的預(yù)處理,接種,37℃培養(yǎng)24h使標(biāo)本MTB擴(kuò)增[9]。然后將菌液與噬菌體液混勻37℃孵育1h,使特異性噬菌體感染、裂解標(biāo)本中的MTB,然后加高度特異的殺病毒劑室溫靜置5min,清除所有未進(jìn)入MTB細(xì)胞內(nèi)的噬菌體。隨即添加敏感細(xì)胞,加培養(yǎng)基制成瓊脂板,37℃18～24h后觀察結(jié)果。如果待檢標(biāo)本中不含MTB,噬菌體則會被殺病毒劑消除,故敏感細(xì)胞不被感染,最終無噬菌斑出現(xiàn)[10]。檢測實驗中為了提高準(zhǔn)確性和敏感性,采取了2次侵染的方法。先讓噬菌體侵染細(xì)菌,然后用殺病毒劑滅活細(xì)菌胞外的噬菌體;再用已測定過可以被噬菌體侵染的敏感細(xì)胞來測試,確定細(xì)菌中裂解出的噬菌體不是環(huán)境污染帶來的。

PhaB起初應(yīng)用于臨床檢測MTB對利福平、異煙肼和喹諾酮的耐藥性[5,11,22],逐漸也用于檢測MTB對乙胺丁醇、異煙酰胺、鏈霉素和環(huán)丙沙星的抗藥性[9]。由于PhaB檢測技術(shù)特異性高而且方法簡便迅速,在檢測方面逐漸受到了廣泛關(guān)注。Shriprakash Kalantri[12]等收集了2000年以來的Medline、EMBASE 和Web of Science and Biosis上的文獻(xiàn),對PhaB應(yīng)用于MTB在臨床樣本檢測的精準(zhǔn)度作了全面的統(tǒng)計學(xué)分析。在痰涂片陽性的樣本中,靈敏度為29%～87%,特異性為60%～88%;在痰涂片陰性樣本中,靈敏度為13%～78%,特異性為89%～99%。分析結(jié)果表明,噬菌體裂解檢測法有高度的特異性(≥83%),總準(zhǔn)確性略高于涂片鏡檢,但靈敏度不太穩(wěn)定(21%～88%),對高濃度M TB標(biāo)本的檢測較為可靠。因此,如何提高噬菌體檢測技術(shù)的敏感性,以滿足臨床實際應(yīng)用是相關(guān)研究者關(guān)注的主要問題。

4 熒光報告系統(tǒng) 在MTB感染的最初階段,短時間的菌血癥就可以引起活菌在體內(nèi)擴(kuò)散[13],導(dǎo)致潛伏感染[14]。而PhaB難以檢測到潛伏感染的數(shù)量極少的活菌,Azger Dusthackeer[11]認(rèn)為可能是噬菌體裂解細(xì)菌造成了AT P的迅速分解,釋放了能量,影響了實驗的敏感性。熒光報告系統(tǒng)(luciferase reporter phages,LRP)是人工重組噬菌體,重組基因能表達(dá)熒光素酶蛋白(reporter fire fly luciferase,FFlux)。噬菌體在M TB內(nèi)增殖后,噬菌體表達(dá)的熒光酶作用于底物外源性熒光素和內(nèi)源性ATP,產(chǎn)生可以檢測到的熒光。LRP法不需要裂解宿主菌,因此常用溫和噬菌體。采樣,預(yù)處理后接種培養(yǎng)MTB 24 h,用 LRP侵染MTB,然后用熒光測量儀檢測。通過測定發(fā)光強(qiáng)度可以檢測待檢分枝桿菌是否繁殖,這種方法大幅度提高了檢測的靈敏性。在過去的幾十年研究中LRP檢測方法一直表現(xiàn)出極大的可發(fā)展性,因此有可能在早期潛伏感染的診斷中得到廣泛應(yīng)用。

5 噬菌體檢測技術(shù)進(jìn)展 影響噬菌體檢測技術(shù)的因素主要有兩方面:采樣、送檢過程中的操作不當(dāng);實驗過程中實驗條件、方法不完善。研究發(fā)現(xiàn),由于噬菌體侵染的是活MTB細(xì)胞,因此病人樣本的采集時間和送檢過程若是存在影響MTB活細(xì)胞數(shù)目的因素,將對檢測結(jié)果造成影響。及時送檢檢測敏感性可以達(dá)到80%左右,而送檢不及時可能造成敏感性只有30%左右[12]。臨床標(biāo)本采集的影響可通過制定相應(yīng)的規(guī)范和對采集者培訓(xùn)等途徑減小,做到早期無菌取樣、及時送檢。因此噬菌體檢測技術(shù)的改進(jìn)主要集中于實驗材料、侵染條件和實驗方法的探索。

5.1 噬菌體侵染和復(fù)制條件 Ruth McNerney[10]認(rèn)為,要獲得最大的檢測敏感性,優(yōu)化噬菌體侵染和復(fù)制的條件是必要的。在使用雙鏈DNA噬菌體D29感染BCG的過程中發(fā)現(xiàn),在37℃7H9培養(yǎng)基中30 min內(nèi)發(fā)生侵染,可以檢出100 CFU/mL的陽性結(jié)果,而在陰性樣品中沒有假陽性出現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn),優(yōu)化侵染和培養(yǎng)時間能得到較高的敏感性,在最佳條件下經(jīng)過1 d培養(yǎng)的樣品陽性率(65%)顯著高于未經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的樣本(40%)[15],培養(yǎng)樣本20～24 h后檢測或是取同一病人的多份樣品檢測也可以提高敏感性[10]。另外,大量實驗發(fā)現(xiàn),要獲得最佳的MTB檢測效果,胞外噬菌體的滅活應(yīng)該控制在最大程度侵染完成后到細(xì)胞裂解前這段時間里。細(xì)胞溶解發(fā)生在135～150 min左右,因此用殺病毒劑,如FAS等滅活噬菌體應(yīng)在半小時以后,但不能超過兩小時。

5.2 噬菌體侵染最適滴度 上海肺病醫(yī)院[15]應(yīng)用PhaB作了關(guān)于痰樣本檢測試驗條件的研究,發(fā)現(xiàn)低濃度的MTB使用高濃度的噬菌體侵染效果較好,37℃200～500/mL的M TB用 1×109PFU/mL的噬菌體侵染60min即可完成檢測。Ruth McNerney[7]實驗發(fā)現(xiàn),噬菌體滴度保持在107～108PFU/mL能獲得較好的侵染效果。在梯度濃度的噬菌體侵染MTB實驗中發(fā)現(xiàn),低濃度的噬菌體并不會造成顯著的侵染效率降低,但當(dāng)噬菌體濃度達(dá)到107PFU/mL時,其感染效率與104PFU/mL相比呈幾何倍數(shù)上升;高濃度下,特別是當(dāng)濃度超過108PFU/mL時,能明顯觀察到噬菌斑減少,原因可能是產(chǎn)生了頓挫感染,因為大量的噬菌體顆粒同時侵入細(xì)菌造成了細(xì)菌胞壁的損壞,因而在子代噬菌體產(chǎn)生之前細(xì)菌已成為不能給病毒提供復(fù)制條件的非容納細(xì)胞[22]。

5.3 溫敏噬菌體 采用 DNA重組技術(shù)對現(xiàn)有分枝桿菌噬菌體進(jìn)行改造,是噬菌體檢測技術(shù)研究的新領(lǐng)域。Phage88是重組的溫敏LRP,在分枝桿菌噬菌體TM4的非必須區(qū)插入含F(xiàn)Flux表達(dá)基因與卡介苗hsp60啟動子的融合體,37℃噬菌體停止增殖。檢測結(jié)果表明,BCG的發(fā)光值最高,恥垢分枝桿菌次之,MTB最低。檢測MTB H37Ra敏感性達(dá)到6.4×104個/mL,檢測 MTB H37Rv敏感性達(dá)到7.6×104個/mL[16]。雖然phage88的特異性和敏感性已經(jīng)得到了較大提高,但目前尚局限于實驗室藥物篩選,應(yīng)用于臨床早期診斷還需要更進(jìn)一步的研究。

5.4 使用強(qiáng)啟動子噬菌體 Svetoslav Bardarov[14]改進(jìn)了LRP檢測方法,構(gòu)建了一種帶有強(qiáng)啟動子lef t的重組體phAE142。phAE142是將phAE85的啟動子hsp60替換成了溫和噬菌體L5的啟動子lef t,從而獲得了高敏感性。實驗發(fā)現(xiàn),同滴度下,phAE142產(chǎn)生熒光強(qiáng)度是phAE85的10～100倍,而檢測需要的時間縮短了2/3,這說明phAE142有更好的感染性。phAE142與MGIT儀器培養(yǎng)法的同條件比較中發(fā)現(xiàn),phAE142檢測的MTB滴度不能小于0.5～1×108CFU/L,在平均滴度109CFU/L下能進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的MTB檢測和藥敏試驗[18]。在用phAE142檢測培養(yǎng)陽性的20例樣本的試驗中,噬菌體檢測法僅未檢測出兩例低滴定度的樣本,但其檢測時間僅有2 d,而MGIT需要1w左右。

5.5 檢測M TB休眠菌 Azger Dusthackeer[7]等利用phAETRC16和phAE159構(gòu)建了3種LRP重組體:phAETRC21、phAET RC201 和 phAETRC202,都獲得了高敏感性,可以檢測處于休眠狀態(tài)的桿菌。phAETRC16由M TB溫和噬菌體Che12衍生,攜帶hsp60啟動子;溫敏噬菌體phAE159由 TM4衍生。phAETRC21是 phAETRC16的衍生株,由啟動子icl啟動FFlux基因。phAET RC201和phAET RC202都是phAE159的衍生株,分別由啟動子hsp60和acr啟動FFlux基因。

研究表明,在溫敏噬菌體TM4的衍生菌中表達(dá)熒光酶基因能增加熒光量,從而提高檢測的敏感性。MTBH37Rv檢測試驗中,重組體phAE159和phAET RC16檢測敏感性分別為4×104和5×105,重組體 phAETRC21、phAET RC201和 phAETRC202檢測敏感性分別為6×105、8×101和2×104。臨床樣本的檢測試驗中,phAE159和 phAETRC16檢測敏感性分別為 6×105和1×107,重組體 phAETRC21、phAET RC201 和 phAET RC202分別為1×107、1×105和1×106。結(jié)果表明,phAETRC201和phAET RC202重組體對MTB有更高的敏感性,并在24h左右檢測到了熒光。研究認(rèn)為,TM4衍生株特有的TMP(tape measure protein)蛋白中的MT3模體可能是增加熒光量的原因。

5.6 藥物聯(lián)用 MTB檢測中,非結(jié)核分枝桿菌感染、其他細(xì)菌的污染或者HIV感染都會造成實驗敏感性和特異性的偏差。因此在合適的實驗條件下進(jìn)行噬菌體檢測,要獲得穩(wěn)定和高度的敏感性,應(yīng)盡量避免實驗中的污染。Albert H[19]利用藥物輔助噬菌體檢測作了相關(guān)試驗,在M TB培養(yǎng)時加入一種抗微生物制劑NOA(含制霉菌素50 000IU/L、苯唑西林2mg/L、氨曲南30mg/L),不會對 MTB生長、感染有影響,但對其他雜菌有較好的抑制效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn),FAST Plaque檢測法的敏感性和準(zhǔn)確性有顯著提高,并且NOA與利福平等抗癆藥物沒有交叉影響。

5.7 噬菌體檢測試劑盒 FASTPlaqueTB試劑盒是近年來商品化的一種噬菌體檢測試劑盒,其基本原理是噬菌體擴(kuò)增裂解法,對噬菌體、反應(yīng)中各試劑以及各步反應(yīng)時間進(jìn)行優(yōu)化。Ayman Mohamed Marei[6]將 FASTPlaqueTB與鏡檢、PCR的對照比較,實驗中采用Actiphage作為特異性噬菌體,比較結(jié)果顯示,FASTPlaqueTB、抗酸染色和PCR的特異性分別為 95%、95%、91%。研究證明,FASTPlaqueTB檢測達(dá)到了臨床檢測的標(biāo)準(zhǔn),在尿樣檢驗中FASTPlaqueTB檢驗結(jié)果有更高的應(yīng)用價值,其靈敏度、特異性和總精準(zhǔn)度分別達(dá)到64%、93%和84%。FASTPlaqueTB檢查法由于其快速(可以當(dāng)天出結(jié)果)、廉價且試驗結(jié)果明顯的特性[20],將有可能替代 PCR和培養(yǎng)法作為臨床診斷的重要方法之一[14]。

6 展 望

結(jié)核病是目前全世界死亡率僅次于艾滋病的感染性疾病,在結(jié)核病流行地區(qū),常由于不能盡早發(fā)現(xiàn)結(jié)核患者,因此無法有效的控制結(jié)核病的傳播、蔓延[17]。噬菌體檢測技術(shù)具有快速、簡便、特異、準(zhǔn)確、作用譜狹窄、技術(shù)要求低、不需特殊的儀器設(shè)備等特點,大大縮短了結(jié)核病的診斷周期,在早期診斷中可以作為檢測的重要指標(biāo)。同時,該方法能初步確定患者是否為活動性結(jié)核患者、潛伏感染者,在抗結(jié)核效果快速評價方面也具有十分重要的意義[14]。

針對噬菌體基因組的重組改造還在不斷地探索中,目前噬菌體檢測方法還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)體系[4]。利用抗微生物制劑抗污染,以及通過改良實驗方法提高檢測準(zhǔn)確性,這兩方面是當(dāng)前研究主要集中的部分?？梢灶A(yù)見,隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)不斷發(fā)展成熟,噬菌體基因組改造將日趨完善,檢測敏感性將更加穩(wěn)定。在結(jié)核分枝桿菌快速檢測、結(jié)核病早期診斷方面,噬菌體技術(shù)具有較大潛力。

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R378

A

1002-2694(2011)08-0738-04

*國家“十一五”重大傳染病專項基金(2008ZX-10003-013)和國家自然科學(xué)基金(30500432)聯(lián)合資助

柏銀蘭,Email:amay0001@sina.com.cn

1.第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系,西安 710032;

2010-11-21;

2011-03-19