倪興維,李宏民,者永輝,閆鴻斌,金 科,賈萬忠

2.西寧市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所,西寧 810003

棘球?qū)?Echinococcus)絳蟲的幼蟲—棘球蚴(echinococcus or hydatid cyst)寄生于動(dòng)物(包括人)體內(nèi),引起一類嚴(yán)重危害人體健康和阻礙畜牧業(yè)發(fā)展的人獸共患寄生蟲病即棘球蚴病(Echinococcosis),又稱包蟲病(hydatid disease)。呈世界性分布,我國是棘球蚴病的高發(fā)區(qū)。目前世界上公認(rèn)的棘球?qū)俳{蟲有5種：細(xì)粒棘球絳蟲(E.granulosus,Eg)、多房棘球絳蟲(E.multilocularis,Em)、少節(jié)棘球絳蟲(E.oligarthus,Eo)、福氏棘球絳蟲(E.vogeli,Ev)和石渠棘球絳蟲(E.shiquicus,Es)。細(xì)粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲、福氏棘球絳蟲的幼蟲均有感染人的報(bào)道,分別引起囊型棘球蚴病(cystic echinococcosis,CE)、泡型棘球蚴病(alveolar echinococcosis,AE)和多囊性棘球蚴病,少節(jié)棘球絳蟲和石渠棘球絳蟲尚無人體感染的確切報(bào)告。目前我國存在有細(xì)粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲和石渠棘球絳蟲3個(gè)種,其中細(xì)粒棘球絳蟲分布最廣,危害最嚴(yán)重。

棘球蚴寄生于牛、羊等反芻動(dòng)物及人體內(nèi),成蟲寄生于犬、貓等食肉動(dòng)物,其生活史自身以及與宿主之間關(guān)系比較復(fù)雜,因此以活體動(dòng)物為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ屯焕谘芯考纳x組成成分、致病機(jī)制、寄生蟲與宿主之間的關(guān)系以及影響寄生蟲生長的因素等。棘球蚴的體外培養(yǎng)使科學(xué)家便于研究棘球絳蟲致病機(jī)制及其與宿主之間的關(guān)系等,從而為更有效地制定控制棘球蚴病流行的策略和尋找理想的防治手段等提供重要指導(dǎo)作用。下面就棘球蚴體外培養(yǎng)方法研究進(jìn)展作一綜述。

1 聯(lián)合培養(yǎng)體系

1.1 “組織-碎片”培養(yǎng)體系(tissue-block system)

1995年,Hemphill等[1]對泡球蚴囊泡進(jìn)行體外培養(yǎng)時(shí),提出了“組織-碎片”培養(yǎng)體系,即從實(shí)驗(yàn)感染鼠的腹腔中分離出泡球蚴組織,剪成一些小碎片,在含有血清的復(fù)合培養(yǎng)基-RPMI 1640(含有10%胎牛血清、12 mmol/L Hepes、2 mmol/L谷氨酰胺、200 U/mL 青 霉素 、200 μ g/mL 鏈霉素 、0.5 μ g/mL兩性霉素 B 和 0.5 μ mol/L β 巰基乙醇)中培養(yǎng),從而觀察泡球蚴的生長發(fā)育情況。研究結(jié)果表明：泡球蚴囊泡的整個(gè)培養(yǎng)過程可分為3個(gè)階段,即最初20～25 d的囊泡快速生長期、第25～80 d的生長減慢期和80～100 d的生長穩(wěn)定期。在培養(yǎng)過程中觀察到泡球蚴組織塊表面在一定時(shí)間后出現(xiàn)小的囊泡樣結(jié)構(gòu),2～3 w后囊泡體積增大,釋放入培養(yǎng)基中。形態(tài)學(xué)觀察可發(fā)現(xiàn),這些新形成的囊泡與直接從實(shí)驗(yàn)感染鼠腹腔或肝臟中分離的囊泡很相似,并且具有分化形成原頭蚴的能力。研究還發(fā)現(xiàn)飼養(yǎng)細(xì)胞對囊泡的體外生長和繁殖具有重要的促進(jìn)作用。Ingold等[2]應(yīng)用此培養(yǎng)體系對泡球蚴囊泡和福氏棘球蚴囊泡進(jìn)行了體外培養(yǎng)特性的比較。結(jié)果顯示,后者的培養(yǎng)生長發(fā)育特性與泡球蚴囊泡所得結(jié)果相似,即福氏棘球蚴囊泡在培養(yǎng)初期,約50%的囊泡分化形成原頭蚴,在培養(yǎng)4個(gè)月時(shí)也觀察不到囊泡大量繁殖的現(xiàn)象,但囊泡體積在逐漸增大,由原來的0.5～4 mm增大到8～10 mm,培養(yǎng)結(jié)束時(shí)約有90%的囊泡孕育著原頭蚴的形成,動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)證實(shí)這些囊泡及其原頭蚴能夠在感染小鼠的腹腔中大量繁殖,仍具有感染性。

1.2 膠原膜培養(yǎng)體系(collagen layer system)

1996年,Jura等[3]利用寄生蟲對中間宿主的親器官性,提出了膠原膜培養(yǎng)體系,即在培養(yǎng)板底層和上層覆蓋膠原纖維層,飼養(yǎng)細(xì)胞和泡球蚴囊泡位于兩夾層中間。研究結(jié)果表明在肝細(xì)胞的培養(yǎng)條件下,泡球蚴囊泡在培養(yǎng)3 w之后,子囊以出芽的方式從包囊長出,數(shù)量由原來的52個(gè)增加到640多個(gè),增加了11倍,體積由原來的平均127 μ m增大到平均為960 μ m,為原來的7倍 ,在 3或 4個(gè)月之后,大的囊泡穿過上層膠原纖維層,從而使大量小的新生囊泡釋放到培養(yǎng)基中,此培養(yǎng)條件下囊泡能夠生長繁殖至少12個(gè)月。而在沒有肝細(xì)胞的培養(yǎng)條件下,在最初培養(yǎng)的幾天能夠觀察到囊泡有適當(dāng)?shù)脑黾?約6 d后囊泡開始死亡,18 d后沒有完整囊泡的存在,從培養(yǎng)開始到結(jié)束囊泡體積基本無變化。結(jié)果表明泡球蚴囊泡在飼養(yǎng)細(xì)胞的存在下具有體外生長繁殖的能力。國內(nèi)陸家海[4]等人利用此培養(yǎng)體系的原理,建立了適合人源細(xì)粒棘球蚴細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法,并首次成功培育出一株人源細(xì)粒棘球蚴細(xì)胞系(13G-5)。

盡管如此,但上述兩種培養(yǎng)體系也存在一定的缺陷。首先,在需要大量寄生蟲材料時(shí),無論是“組織-碎片”培養(yǎng)體系還是膠原膜培養(yǎng)體系所獲得的囊泡的數(shù)量都是有限的,特別是“組織-碎片”培養(yǎng)體系;其次,這兩種培養(yǎng)體系都一直存在宿主細(xì)胞的污染;最后,在這兩種培養(yǎng)體系中,由于宿主細(xì)胞持續(xù)存在,不能清楚地區(qū)分已有宿主細(xì)胞因子對寄生蟲生長是直接影響還是間接影響。

1.3 大規(guī)模液體培養(yǎng)體系(large-scale liquid cultivation system) 為了滿足研究者對大量寄生蟲材料的需求,Spiliotis等[5]對泡球蚴囊泡進(jìn)行培養(yǎng)時(shí),提出了第三種聯(lián)合培養(yǎng)體系即“大規(guī)模液體培養(yǎng)系統(tǒng)”。與膠原膜培養(yǎng)體系相比,此體系沒有膠原纖維層,但每周都要向培養(yǎng)基中加入少量用胰酶消化的新鮮肝細(xì)胞來代替死亡的飼養(yǎng)細(xì)胞,這樣具有有絲分裂活性的肝細(xì)胞能夠分泌一些有利于寄生蟲生長的生長因子。研究結(jié)果表明：此培養(yǎng)體系可獲得大量的成熟程度有所不同的泡球蚴囊泡,并且所培養(yǎng)的囊泡具有向原頭蚴階段生長發(fā)育的能力,但是在沒有飼養(yǎng)細(xì)胞存在的條件下,囊泡就會(huì)迅速死亡。

盡管聯(lián)合培養(yǎng)體系能夠獲得一些研究所需囊泡,但是要進(jìn)一步研究宿主因素對于寄生蟲生長的影響時(shí),這些培養(yǎng)體系的作用還是非常有限的,因?yàn)轶w系中宿主細(xì)胞持續(xù)存在的問題未能得到解決(無論是從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分離寄生蟲組織時(shí)帶入的,還是組織-碎片中存在的)。如果向培養(yǎng)基中加入或移去已確定的宿主因素來研究它們對寄生蟲生長的影響,那就不能清楚地區(qū)分它們對寄生蟲的影響是直接的還是由于污染的宿主細(xì)胞間接引起的。為了能夠在完全沒有宿主細(xì)胞存在的條件下來研究寄生蟲的生長狀況及寄生蟲與宿主之間的作用關(guān)系等,使得另一種培養(yǎng)體系——“無宿主成分干擾”培養(yǎng)體系備受關(guān)注。

2 “無宿主成分干擾”培養(yǎng)體系

Seidel等[6-8]報(bào)道：在沒有宿主飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)條件下,厭氧環(huán)境和向培養(yǎng)基中加入還原劑對短小膜殼絳蟲(Hymenolepis nana)、黃鼠膜殼絳蟲(H.citelli)及縮小膜殼絳蟲(H.diminuta)蚴的生長是必須的;Ivanchenko等[9-10]對曼氏血吸蟲的研究表明：在體外將光滑雙臍螺胚胎細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí),血吸蟲囊蚴就會(huì)迅速繁殖,并產(chǎn)生子代包囊,而在沒有飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下,囊蚴只有在厭氧和有還原劑條件下才能存活。

在此基礎(chǔ)上,Spiliotis等[11]首次建立了對泡球蚴囊泡長期體外培養(yǎng)的“無宿主成分干擾”培養(yǎng)系統(tǒng)即無宿主因子污染及厭氧的培養(yǎng)體系。將聯(lián)合培養(yǎng)條件下獲得的囊泡分別在4種不同培養(yǎng)條件下觀察泡球蚴囊泡的生長過程。研究發(fā)現(xiàn)泡球蚴囊泡能夠在體外“無宿主成分干擾”條件下存活數(shù)個(gè)月,而在有氧環(huán)境中,2～3 w內(nèi)囊泡迅速死亡;當(dāng)囊泡在含有10%的血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),能夠存活數(shù)周,但不能夠生長繁殖,而只有在宿主細(xì)胞存在的條件下,囊泡才能生長繁殖,并且可以觀察到原頭蚴的出現(xiàn);在不含L-半胱氨酸而含β-巰基乙醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),泡球蚴囊泡也能夠存活生長,但其數(shù)量比同時(shí)含有二者時(shí)低。結(jié)果表明：(1)血清的存在也是囊泡存活所必須的,(2)只有在特定培養(yǎng)基條件下泡球蚴才能夠生長分化,(3)還原劑和無氧條件(即含有β-巰基乙醇、L-半胱氨酸、氮?dú)?、胎牛血清、青鏈霉素、DMEM)是泡球蚴囊泡生長繁殖所必須的。然而泡球蚴囊泡對有氧環(huán)境具有特殊敏感性的原因尚不太清楚,但已開展相關(guān)研究。Spiliotis[12]在研究中發(fā)現(xiàn)泡球蚴對氧敏感是因?yàn)槿狈τ谢钚缘倪^氧化氫酶,這一點(diǎn)在細(xì)粒棘球蚴的研究中也被證實(shí)[13];Matsumoto等[14]報(bào)道,多房棘球絳蟲原頭蚴的線粒體呼吸系統(tǒng)特別適應(yīng)于厭氧環(huán)境,可以合理的推斷泡球蚴其它組織細(xì)胞的線粒體呼吸系統(tǒng)也適應(yīng)于厭氧環(huán)境。因此,在對體外培養(yǎng)時(shí),對還原劑和厭氧環(huán)境的需要是必須的,但這并不意味著培養(yǎng)相關(guān)物種時(shí)就需要相同的培養(yǎng)環(huán)境,如膜殼絳蟲屬的微口膜殼絳蚴蟲(H.microstoma)在體外培養(yǎng)時(shí)不需要還原劑或厭氧環(huán)境就能完全生長[15]。

在國內(nèi),溫浩等[16]對泡球蚴囊泡進(jìn)行體外培養(yǎng)研究表明：在有肝癌細(xì)胞系存在的條件下,體外培養(yǎng)后泡球蚴囊泡增多,到22 d時(shí)其數(shù)量是開始培養(yǎng)第3～4 d的6～7倍;隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,囊泡的直徑也在增加,最大直徑達(dá)6 mm,小的約0.5 mm,在第22 d時(shí)約有30%為大的囊泡,70%為小的囊泡,并且一些具有出芽生殖能力,其形態(tài)介于原頭蚴和囊泡之間。

較聯(lián)合培養(yǎng)體系來說,“無宿主成分干擾”培養(yǎng)體系具有一些特殊優(yōu)點(diǎn)。第一,在沒有宿主細(xì)胞的條件下也能形成囊泡,這對于一些研究是非常重要的,也是必須的,如棘球絳蟲基因組DNA的分離及cDNA文庫的構(gòu)建;第二,在培養(yǎng)基中加入已知的與寄生蟲生長有關(guān)的生長因子,可以觀察到其對寄生蟲的直接作用;第三,通過對“無宿主成分干擾”培養(yǎng)得到的囊泡進(jìn)行胰蛋白酶消化,可以得到無宿主細(xì)胞污染的原代細(xì)胞。但是,體外培養(yǎng)體系也存在一定的缺陷即主要用于感染后期的研究,而不能用于感染早期的研究。為了能夠?qū)蝌矢腥局虚g宿主的早期階段進(jìn)行研究,有必要建立棘球絳蟲原代細(xì)胞的培養(yǎng)體系,以便為棘球蚴病的控制與治療提供重要理論依據(jù)和指導(dǎo)作用。

3 原代細(xì)胞培養(yǎng)體系

由于細(xì)胞培養(yǎng)對于分子生物學(xué)研究具有巨大的潛力,因此到目前為止已經(jīng)有很多方法用于泡球蚴、細(xì)粒棘球蚴和其它絳蟲蚴的原代細(xì)胞培養(yǎng)及其細(xì)胞系的建立。在所有相關(guān)研究中,都是采用體內(nèi)培養(yǎng)的寄生蟲材料用于原代細(xì)胞培養(yǎng),但宿主細(xì)胞的污染仍然是一個(gè)非常嚴(yán)峻的問題。

Fiori等[17]報(bào)道,從細(xì)粒棘球蚴生發(fā)層細(xì)胞所分離的原代細(xì)胞進(jìn)行長期培養(yǎng)時(shí),所培養(yǎng)的細(xì)胞不具有其自身細(xì)胞的特征,而是具有哺乳動(dòng)物成纖維細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn),所培養(yǎng)的細(xì)胞的核型與宿主細(xì)胞的核型很相似。相關(guān)研究人員推測：Fiori等所得到的結(jié)果只是對宿主細(xì)胞的培養(yǎng),而并非對細(xì)粒棘球蚴細(xì)胞的培養(yǎng)。Furuya等[18]對泡球蚴細(xì)胞系的建立進(jìn)行了研究,但并沒有證實(shí)這些泡球蚴細(xì)胞的組織器官來源。此外,其所培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)與Fiori所培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)相似,即所分離的細(xì)胞具有成纖維細(xì)胞樣的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)和宿主細(xì)胞樣的核型。由于沒有使用還原劑或厭氧培養(yǎng)體系,因此其很有可能也是對污染的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)而不是泡球蚴細(xì)胞的培養(yǎng)。Dieckmann等[19-20]從泡球蚴和巨頸帶絳蟲(Taenia crassiceps)蚴的囊泡中分離出原代細(xì)胞,將其在體內(nèi)培養(yǎng)時(shí)能夠形成具有活性的囊泡,表明這些絳蟲蚴囊泡具有巨大的再生能力,且生發(fā)層細(xì)胞是它們再生的唯一來源。Yamashitae等[21]將體內(nèi)培養(yǎng)的泡球蚴囊泡作為寄生蟲原代細(xì)胞培養(yǎng)的來源,并將培養(yǎng)溫度維持在25℃,目的是限制宿主細(xì)胞的過度增長。通過這種方法能夠使生發(fā)層細(xì)胞在體外存活達(dá)28 d,但不能生長繁殖,并且在28 d之后細(xì)胞就開始迅速衰亡。因此,可以說棘球蚴細(xì)胞體外培養(yǎng)面臨的一個(gè)主要挑戰(zhàn)就是：尋找適合于棘球絳蟲蚴生發(fā)細(xì)胞生長的培養(yǎng)體系和消除宿主細(xì)胞的污染。

Spiliotis等[22]應(yīng)用“無宿主成分干擾”培養(yǎng)體系培養(yǎng)的泡球蚴囊泡作為生發(fā)細(xì)胞的來源進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng),并且利用還原劑/厭氧培養(yǎng)體系,成功地克服了以上這些問題,建立了泡球蚴囊泡的原代細(xì)胞培養(yǎng),并證實(shí)所分離培養(yǎng)的細(xì)胞是泡球蚴細(xì)胞而不是宿主細(xì)胞。研究結(jié)果表明：原代細(xì)胞在還原劑和厭氧環(huán)境條件及含有囊液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),幾周之內(nèi)夠就能分裂增殖,并形成小的細(xì)胞聚集體;當(dāng)飼養(yǎng)細(xì)胞存在時(shí),能夠迅速增殖,約3 w時(shí)會(huì)形成細(xì)胞小體,到5 w時(shí)就會(huì)形成中心腔(原始腔),到6 w之后就能形成成熟的泡球蚴囊泡(含有角質(zhì)層和生發(fā)層),并且這些新形成的囊泡具有感染性。這是該領(lǐng)域已取得的突破性進(jìn)展,必將推動(dòng)其它絳蟲蚴體外培養(yǎng)技術(shù)的飛速發(fā)展。Albani等[23]用胰蛋白酶處理細(xì)粒棘球蚴來獲得原代細(xì)胞,在含有還原劑和胰島素的“無宿主成分干擾”培養(yǎng)體系中培養(yǎng)。結(jié)果表明：在培養(yǎng)24 h后,這些細(xì)胞分裂繁殖,貼壁生長;在48 h后可以發(fā)現(xiàn)其數(shù)量倍增,這表明原代細(xì)胞具有快速的增殖能力;在3～4 w后細(xì)胞聚集在一起,與鄰近的細(xì)胞形成單細(xì)胞層,能夠觀察到小的聚集體粘附在培養(yǎng)皿底;當(dāng)培養(yǎng)皿內(nèi)表面完全被生長增殖的細(xì)胞粘附時(shí),這些單細(xì)胞層就會(huì)形成一些小塊,懸浮在上清中,當(dāng)轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中時(shí),這些小塊就會(huì)粘附在內(nèi)表面,細(xì)胞開始繁殖,最后形成囊泡,但其是否具有感染性還需要進(jìn)一步的研究。

4 培養(yǎng)體系的應(yīng)用

近年來,隨著棘球蚴體外培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展成熟,使棘球蚴致病機(jī)制、免疫應(yīng)答及治療藥物研究等得到迅速發(fā)展,并取得一定的成果。Bernthaler等[24]利用體外培養(yǎng)體系,研究發(fā)現(xiàn)多房棘球絳蟲中A-I結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)脂蛋白(Apolipoprotein A-I Binding Protein,EmABP)的編碼基因Emabp在多房棘球絳蟲的幼蟲和成蟲階段均有表達(dá),并且它具有一段信號肽,但這段信號肽在日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)中是缺少的。運(yùn)用特異抗體和免疫沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)EmABP存在于感染動(dòng)物體內(nèi)和體外培養(yǎng)的泡球蚴囊泡中,且它是膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)體-高密度脂蛋白的主要成分,主要存在于囊液中。此外,純化的重組EmABP能與人血清中的A-I轉(zhuǎn)脂蛋白相互作用,產(chǎn)生沉淀。因此,根據(jù)高等生物中A-I結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)脂蛋白的功能特點(diǎn),表明EmABP在泡球蚴中的膽固醇和脂肪參與的各種機(jī)制中具有重要的作用。Hemphill等[25]利用“無宿主成分干擾”培養(yǎng)體系,研究發(fā)現(xiàn)泡球蚴磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(Echinococcus multilocularisphosphoglucose isomerase,EmPGI)存在于泡球蚴生發(fā)層、角質(zhì)層及囊液中,除了具有糖酵解作用外,在刺激泡球蚴生長及泡球蚴在體內(nèi)生長過程中誘導(dǎo)新血管的形成和調(diào)節(jié)宿主-寄生蟲相互作用方面起著重要的作用。Reuter等[26-27]通過泡球蚴體外培養(yǎng)體系,證明兩性霉素B不但可以有效抑制泡球蚴的生長,而且出現(xiàn)破壞囊泡作用的時(shí)間比阿苯達(dá)唑早,而同時(shí)使用這兩種藥物時(shí)卻對囊泡的破壞有抑制作用。當(dāng)停止加入藥物時(shí),囊泡出現(xiàn)再生長現(xiàn)象,而先后使用這兩種藥物比單獨(dú)使用兩性霉素B對囊泡的破壞作用明顯?？梢钥闯?通過體外培養(yǎng)體系,可進(jìn)一步了解寄生蟲的生長過程及致病免疫機(jī)制及藥物作用機(jī)制等,對寄生蟲病的防治具有重要意義。

5 結(jié) 語

由于寄生蟲生活史較復(fù)雜,加之對營養(yǎng)要求高,因此體外培養(yǎng)比較困難,這也是該領(lǐng)域發(fā)展比較緩慢的一個(gè)主要原因。棘球絳蟲“無宿主成分干擾”體外培養(yǎng)體系的建立極大地促進(jìn)了相關(guān)的研究,尤其是對寄生蟲-宿主相互作用機(jī)制及抗寄生蟲藥物的研究,而原代細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立能夠更好地從分子水平上對寄生蟲進(jìn)行相關(guān)的研究。隨著各種培養(yǎng)體系的建立和改進(jìn),有希望對寄生蟲各個(gè)發(fā)育階段進(jìn)行更深入細(xì)致的研究。

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