王小妹 王 鵬 綜述 姚新生 審校

(遵義醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室貴州省免疫學(xué)研究生教育創(chuàng)新基地,遵義563003)

B細(xì)胞是介導(dǎo)機(jī)體體液免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞群,其識(shí)別、結(jié)合抗原主要依賴互補(bǔ)決定區(qū)(CDR),它決定著抗體的特異性,而互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)比CDR1、CDR2更具多樣性[1],通過觀察機(jī)體 B細(xì)胞BCRCDR3受體庫的多樣性、重疊率的大小、CDR3區(qū)的基因/氨基酸組成特征、各亞家族的偏向取用等,可以觀察生理及病理狀態(tài)下機(jī)體免疫的相關(guān)情況。高通量測(cè)序能對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行全貌、細(xì)致的分析,目前在國外已開展并應(yīng)用于B細(xì)胞BCRCDR3受體庫測(cè)序。

1 B細(xì)胞BCRCDR3受體庫概述

機(jī)體體液免疫應(yīng)答主要由B細(xì)胞介導(dǎo),其通過產(chǎn)生特異性抗體來應(yīng)答抗原,對(duì)機(jī)體起重要保護(hù)作用。B細(xì)胞識(shí)別抗原主要依賴BCR,BCR是由兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(κ或λ)組成的四聚體,其可變區(qū)和恒定區(qū)分別由不同染色體上的多個(gè)不連續(xù)基因片段重排所編碼。人的κ鏈(2p11.2)和λ鏈(22q11.2)由“Vn-Jn-C”基因重排形成,H 鏈(14q32.33)由“Vn-Dn-Jn-Cn”基因重排形成,其可變區(qū)包含三個(gè)高變區(qū),分別為 :CDR1、CDR2、CDR3,而決定 B 細(xì)胞識(shí)別抗原肽的關(guān)鍵部位是最具多樣性的重鏈CDR3區(qū),其由“IGHV(51個(gè)功能性基因片段)末端-IGHD(23個(gè)功能性基因片段)--IGHJ前端(6個(gè)功能性基因片段)”(http://www.imgt.org/IMGT-GENE-DB/GENElect?livret=0)基因重排及“V—D”和“D—J”連接時(shí)中間插入或剪接的核苷酸序列組成,類型轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞高頻突變都能促成其多樣性形成[2](單個(gè)人由于重鏈、輕鏈本身的多樣性及重、輕鏈配對(duì)組合的多樣性至少能形成1011種以上B細(xì)胞受體)[3]。由于其驚人的多樣性,正常機(jī)體幾乎能對(duì)所有侵入機(jī)體的異物產(chǎn)生應(yīng)答[4]。每種克隆B細(xì)胞BCR有著特定CDR3序列組成,當(dāng)抗原進(jìn)入機(jī)體,就會(huì)引起其特異性B細(xì)胞克隆擴(kuò)增并產(chǎn)生相應(yīng)抗體對(duì)抗原應(yīng)答。由于B細(xì)胞BCRCDR3區(qū)是B細(xì)胞識(shí)別抗原的主要部位,其長度及多樣性都會(huì)影響它對(duì)抗原的識(shí)別與親和力,故B細(xì)胞的特異性可以認(rèn)為是基因重組和體細(xì)胞高頻突變形成特異CDR3的結(jié)果,CDR3序列多變的特征為抗原的選擇提供一個(gè)多樣化的B細(xì)胞受體庫。通過分析B細(xì)胞BCRCDR3受體庫,能為監(jiān)測(cè)和分析生理及病理狀態(tài)下機(jī)體的免疫狀況及B細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供新思路、新方法和手段。

2 B細(xì)胞BCRCDR3受體庫的監(jiān)測(cè)方法

B細(xì)胞BCRCDR3受體庫相關(guān)研究方法眾多,如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)[5]是利用DNA或RNA單鏈構(gòu)象具有多態(tài)性的特點(diǎn),結(jié)合PCR技術(shù)進(jìn)行基因檢測(cè)的一種分析技術(shù)。利用聚丙烯酰胺電泳或毛細(xì)管電泳技術(shù)將PCR擴(kuò)增片段按序列大小分離,出現(xiàn)單一條帶考慮為含相應(yīng)V基因家族的B細(xì)胞存在單克隆重排。但此方法存在操作繁瑣,且只能對(duì)序列突變進(jìn)行初步分析,不能觀察到序列的具體堿基組成及突變點(diǎn)的問題。隨著核酸末端標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展,用“免疫譜型分析技術(shù)(Immunespectratyping)”[6-8](或“免疫掃描(指紋)技術(shù)(Immunoscope))來研究CDR3序列得到較為廣泛的應(yīng)用,通過在上游或下游引物的5′端標(biāo)記FAM等熒光素,利用測(cè)序膠掃描技術(shù)(GeneScan等軟件)、毛細(xì)管電泳技術(shù)(PeakScan等軟件)分析CDR3區(qū)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物各V基因家族序列的長度和多、寡、單克隆偏向性,來判斷所代表的相應(yīng)T&B細(xì)胞的增生情況。這種基于分析CDR3區(qū)長度和多態(tài)性的技術(shù)自上世紀(jì)90年代初應(yīng)用以來,推動(dòng)了TCR&BCRCDR3受體庫在多種生理和病理狀態(tài)下的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究。該方法能很好地觀察到CDR3譜系漂移,結(jié)合測(cè)序還能觀察到部分序列組成,但成本高、操作復(fù)雜。另外,基于對(duì)相應(yīng)探針進(jìn)行各種標(biāo)記(同位素、熒光素等),用核酸雜交技術(shù)[9,10]分析相應(yīng)V或J基因家族組成的CDR3序列的表達(dá)頻率等方法在T&B細(xì)胞受體庫研究中得到較廣的應(yīng)用。

上述方法均只能粗略地對(duì)序列多樣性程度及高變區(qū)長度多態(tài)性分布或部分序列組成進(jìn)行分析,所獲數(shù)據(jù)局限且易出現(xiàn)偏差,要深入且動(dòng)態(tài)地監(jiān)測(cè)CDR3譜型,快速、全面觀察個(gè)體B細(xì)胞BCR CDR3受體庫序列的組成和特征,以及個(gè)體間的重疊率,研究其與疾病或與疾病活動(dòng)情況的關(guān)聯(lián);對(duì)比分析同一疾病患者B細(xì)胞BCR CDR3受體庫;比較患有某疾病的個(gè)體與正常個(gè)體B細(xì)胞BCR CDR3受體庫的差異等問題,尚待進(jìn)一步在基因水平對(duì)B細(xì)胞受體庫進(jìn)行深入研究。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和人類基因組計(jì)劃的順利實(shí)施,基因診斷已逐漸進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)室,成為臨床檢驗(yàn)的常規(guī)項(xiàng)目,其中DNA測(cè)序是基因診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。DNA測(cè)序技術(shù)自發(fā)明以來一直在推動(dòng)分子生物學(xué)發(fā)展方面起著至關(guān)重要的作用,它從根本上改變了人們研究所有生命藍(lán)圖的方式,并且推動(dòng)了基因組學(xué)及其分支乃至其他密切相關(guān)學(xué)科的創(chuàng)立與發(fā)展,如生物信息學(xué),系統(tǒng)信息學(xué),基因組學(xué)及合成生物學(xué)等。DNA測(cè)序技術(shù)的進(jìn)展使生命研究的基本元素發(fā)生了轉(zhuǎn)變,從單一、局部的基因或基因片段轉(zhuǎn)變成整個(gè)基因組,要大批量、準(zhǔn)確的檢測(cè)序列組成變化需應(yīng)用近年發(fā)展起來的高通量測(cè)序技術(shù)。

高通量測(cè)序技術(shù)又稱“下一代測(cè)序技術(shù)”或“深度測(cè)序”或“第二代測(cè)序技術(shù)”,是對(duì)傳統(tǒng)測(cè)序的一次革命性改變,一次能對(duì)幾十萬到幾百萬DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定,使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行全貌、細(xì)致的分析成為可能。高通量測(cè)序中三種代表性的第二代測(cè)序技術(shù)為Roche 454、Illumina Genome Analyzer、ABI SOLiD sequencer,羅氏公司的454測(cè)序儀(Roche GS FLX sequencer,http://www.454.com)是世界上第一個(gè)可以提供超高通量基因組和長片段DNA測(cè)序的商業(yè)化系統(tǒng)設(shè)備。該系統(tǒng)采用一種基于焦磷酸測(cè)序原理而建立起來的高通量基因組測(cè)序技術(shù),通過納米技術(shù)、微流體技術(shù)和微陣列技術(shù)的結(jié)合,拼接超高通量的DNA片段得到完整的基因組。其每個(gè)反應(yīng)可以得到100萬個(gè)以上序列讀長,序列平均讀長可達(dá)450 bp,每天可以產(chǎn)出1億個(gè)以上堿基數(shù)據(jù);同時(shí),Roche于2010年推出了精巧型高通量基因組測(cè)序儀“Roche GSJunior”,平均每次運(yùn)行可獲10萬個(gè)400 bp左右的序列,有很大的推廣應(yīng)用價(jià)值;Illumina公司的Solexa基因組分析儀(Illumina Genome Analyzer,http://www.illumina.com.cn,將“合成測(cè)序”化學(xué)法與“DNA簇技術(shù)”相結(jié)合),于2010年推出的HiSeq 2000系統(tǒng),它每天的測(cè)序通量高達(dá)25 Gb,單個(gè)讀長達(dá)到100 bp;ABI的SOLiD測(cè)序儀(ABISOLiD sequencer,http://www.appliedbiosystems.com.cn/,基于序列連接的化學(xué)法),在2010年推出的SOLiD 5500xl每天的測(cè)序通量高達(dá)30 Gb,單個(gè)讀長為75 bp。這些測(cè)序方法能大大縮短測(cè)序的時(shí)間,使得對(duì)一個(gè)物種的基因組進(jìn)行細(xì)致、全貌的分析成為可能。最適合CDR3受體庫分析的是Roche 454高通量測(cè)序技術(shù),因?yàn)槠錅y(cè)序讀長為450 bp左右,而目前CDR3受體庫的制備,最優(yōu)化和簡便的是在V區(qū)設(shè)計(jì)上游引物,在C區(qū)設(shè)計(jì)下游引物,擴(kuò)增CDR3受體庫的PCR產(chǎn)物在400 bp左右,用Roche 454高通量測(cè)序儀單向測(cè)序便能完整的測(cè)出PCR產(chǎn)物的全長,并直接的進(jìn)行分析。而Illumina Genome-Analyzer、ABI SOLiD sequencer因讀長有限,需要對(duì)CDR3受體庫的制備進(jìn)行多次的優(yōu)化;同時(shí),測(cè)序時(shí)需進(jìn)行雙向測(cè)序和數(shù)據(jù)對(duì)接。

高通量測(cè)序是一種高效、準(zhǔn)確、靈敏度高、自動(dòng)化的基因測(cè)序方法,它主要是應(yīng)用特異性引物擴(kuò)增目標(biāo)序列,將擴(kuò)增產(chǎn)物電泳,對(duì)目的區(qū)有條帶者進(jìn)行測(cè)序。不同于常規(guī)引物,如在B細(xì)胞BCR CDR3受體庫的監(jiān)測(cè)中,以cDNA為模板,再根據(jù)基因特點(diǎn),將IGHV分為六個(gè)家族,并設(shè)計(jì)六條上游引物(包括90%以上V區(qū)基因);依據(jù)IgM、IgG、IgA序列設(shè)計(jì)三條下游引物,并根據(jù)個(gè)體的不同加上不同“標(biāo)簽”(由10個(gè)特異性堿基序列組成),此即特異性引物。每個(gè)個(gè)體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列都帶有特異性標(biāo)記,經(jīng)電泳、膠回收、純化后,所有樣本產(chǎn)物就能作為一個(gè)樣本進(jìn)行反應(yīng)測(cè)序。分析結(jié)果時(shí)可根據(jù)特異性標(biāo)記區(qū)分樣本。高通量測(cè)序簡化了樣本準(zhǔn)備步驟(測(cè)序前僅需把樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增),縮小了反應(yīng)體系,節(jié)約了試劑,現(xiàn)在國外已將其初步應(yīng)用于T、B細(xì)胞序列分析[2-4,11-15]。

3 B細(xì)胞BCR CDR3受體庫的分析

3.1 生理狀態(tài)下B細(xì)胞BCRCDR3受體庫的分析每個(gè)個(gè)體的BCR CDR3受體庫中存在一定數(shù)量、多樣性的CDR3序列,那么不同個(gè)體該庫的大小、多樣性會(huì)一致嗎?并且,由于遺傳基因和所處環(huán)境差異,每個(gè)個(gè)體都存在獨(dú)特性B細(xì)胞BCRCDR3序列,那么獨(dú)特性B細(xì)胞BCR CDR3受體庫在個(gè)體間的分布是怎樣的呢?個(gè)體間的CDR3受體庫的重疊率是怎樣的呢?受體庫的大小和多樣性會(huì)隨年齡變化嗎?這些問題都仍待解決。同時(shí),對(duì)一些分化來源存在爭議的B細(xì)胞亞群也可以通過分析它們的BCR CDR3序列用以鑒定,如Wu等[2]通過Roche 454高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)B細(xì)胞受體庫,分析了轉(zhuǎn)換后記憶B細(xì)胞和IgM記憶B細(xì)胞的關(guān)系。對(duì)于IgM記憶B細(xì)胞的來源一直有爭議,主要有三種假設(shè):首先,有研究者認(rèn)為其是胸腺依賴性抗原刺激產(chǎn)生的生發(fā)中心中還未經(jīng)歷類型轉(zhuǎn)換的記憶細(xì)胞,因?yàn)橛袌?bào)道稱高頻突變先于類型轉(zhuǎn)換,且這兩個(gè)過程是可以分開的;另有研究者認(rèn)為其可能是來自胸腺非依賴性抗原刺激產(chǎn)生的生發(fā)中心形成的,因?yàn)镮gM記憶B細(xì)胞在機(jī)體應(yīng)答胸腺非依賴性抗原中發(fā)揮重要作用;還有研究者認(rèn)為該記憶B細(xì)胞不需要抗原刺激即存在,因?yàn)樵谔褐屑窗l(fā)現(xiàn)有該種細(xì)胞存在。通過分析發(fā)現(xiàn),這兩種細(xì)胞受體庫有較大差異,IgM記憶細(xì)胞比轉(zhuǎn)換后記憶B細(xì)胞IGHV1取用率下降而高取用了IGHV3,序列中帶負(fù)電及脂肪族氨基酸含量較少,故認(rèn)為IgM記憶B細(xì)胞和轉(zhuǎn)換后記憶B細(xì)胞來源不盡相同,IgM記憶B細(xì)胞可能來源眾多。另有研究應(yīng)用Roche 454高通量測(cè)序分析四種不同家族的14條斑馬魚的抗體庫(IgM和IgZ)[15]。斑馬魚是進(jìn)化過程中具有最早可識(shí)別的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的物種,并且與人的基本組成類似,它也取用重組活化基因(RAG)和V、D、J重組以產(chǎn)生抗體,但斑馬魚免疫系統(tǒng)僅含約300 000個(gè)能產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞,比人類要簡單5個(gè)數(shù)量級(jí)。每條魚檢測(cè)到28 000～112 000條有效序列(分辨出V、D、J的取用,正確率達(dá)98%),斑馬魚的VDJ庫理論上為975種(39V*5D*5J),則在每條被研究的斑馬魚中,VDJ庫的覆蓋率達(dá)50%～86%。并且每個(gè)個(gè)體的VDJ庫及抗體重鏈的多樣性分布相似,不同個(gè)體有相同IgH鏈取用趨勢(shì),甚至有兩個(gè)個(gè)體共同取用245種序列,有5個(gè)個(gè)體共同取用2種序列;同一家族部分個(gè)體間VDJ取用具高相關(guān)性。Boyd等[4]通過454高通量測(cè)序?qū)?2個(gè)人的B細(xì)胞受體庫分析,檢測(cè)到108210條IgH重組序列并確定了它們的基因型。已報(bào)告功能性IGHV基因及其等位基因的多樣性為45～60種,由于基因雜合的多樣性水平,研究者發(fā)現(xiàn)了之前未報(bào)告過的 14種 IGHV多態(tài)性,并且 IGHD3-16、IGHJ6基因的多態(tài)性也被發(fā)現(xiàn);還確證了IGHV3-33*05、IGHV3-66*02和 IGHV4-31*01等9種基因是存在的,并質(zhì)疑 IGHJ3*01、IGHJ4*01、IGHJ5*01和IGHJ6*01等位基因是否報(bào)告錯(cuò)誤,與其它報(bào)告一致[16]。而Glanville等[3]采用454高通量測(cè)序?qū)?54個(gè)樣本的B細(xì)胞受體庫進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)重鏈CDR3區(qū)長度為1～31個(gè)氨基酸,服從正態(tài)分布,在其大部分位點(diǎn),每種氨基酸都有分布;CDR1和CDR2都具有一定的多樣性,這種多樣性主要來自種系基因多態(tài)性和高頻突變,并且重、輕鏈的隨機(jī)配對(duì)也能產(chǎn)生部分多樣性(48H*53L=2544)。另外,有研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體T細(xì)胞TCR CDR3序列V、D、J各家族的取用有非隨機(jī)現(xiàn)象[17],那么在B細(xì)胞受體庫中各家族的取用是否隨機(jī)呢?現(xiàn)在B細(xì)胞BCR CDR3受體庫數(shù)據(jù)尚不完善,隨技術(shù)改革,通過進(jìn)一步分析,將識(shí)別低頻出現(xiàn)在群體中的等位基因,觀察到不常見的重組序列,或能觀察到更多基因多態(tài)性與疾病的關(guān)聯(lián)。

疫苗接種是目前預(yù)防疾病的最好方法之一,已開發(fā)了多種類型疫苗,如基因工程疫苗、亞單位疫苗、合成肽疫苗等,廣泛應(yīng)用于預(yù)防乙肝、狂犬病、白喉等疾病。但接種后效果的檢測(cè)目前僅停留在蛋白水平,對(duì)于在基因水平動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和分析抗體的發(fā)生與發(fā)展仍待進(jìn)一步探索。B細(xì)胞受體對(duì)抗原應(yīng)答主要依賴其CDR3區(qū)識(shí)別抗原表面分子,一種表面分子能與所有B細(xì)胞受體的CDR3區(qū)結(jié)合的幾率非常低,最后與該表面分子具最適親和力的B細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生活化與應(yīng)答[18,19]。如通過動(dòng)態(tài)觀察B細(xì)胞BCR CDR3受體庫可在基因水平觀測(cè)機(jī)體針對(duì)某疫苗的免疫應(yīng)答情況,并能對(duì)其主要受體序列進(jìn)行分析,還能為某些仍缺乏良好免疫效果疫苗的疾病開發(fā)新型疫苗提供新思路。單克隆抗體現(xiàn)廣泛用于檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)診斷試劑盒、腫瘤的導(dǎo)向治療和放射免疫顯像技術(shù)等方面,但傳統(tǒng)的方法如單細(xì)胞 PCR擴(kuò)增V區(qū)[20,21]、用 EB病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[22]、分析和掃描重組抗體庫[23],都依賴復(fù)雜而精確度不高的掃描技術(shù)。Reddy等[13]通過454高通量測(cè)序分析免疫后鼠的B細(xì)胞受體庫,挑出頻率較高的重鏈和輕鏈序列,將其自動(dòng)化基因合成并連接到細(xì)菌等載體上,從而無需掃描即能生產(chǎn)單克隆抗體。

3.2 B細(xì)胞BCRCDR3受體庫分析與疾病的預(yù)測(cè)、診斷和預(yù)后 B細(xì)胞是機(jī)體免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞群,當(dāng)某些對(duì)機(jī)體具重要免疫保護(hù)效應(yīng)的BCR CDR3序列缺失時(shí)會(huì)引起機(jī)體易患某些疾病。如有研究者發(fā)現(xiàn)一無明顯癥狀的貧血患者體內(nèi)染色體有六種IGHD基因缺失,這就影響了B細(xì)胞受體的多樣性表達(dá),進(jìn)而影響了機(jī)體的免疫功能[4]。是否是由于這種缺失引起了無癥狀貧血仍待進(jìn)一步探索,但為研究貧血的發(fā)病機(jī)制提供了新思路,并可推測(cè)通過大范圍對(duì)B細(xì)胞受體基因進(jìn)行分析,或發(fā)現(xiàn)某些基因位點(diǎn)與疾病存在關(guān)聯(lián),研究還發(fā)現(xiàn)在某些惡性疾病癥狀出現(xiàn)之前,檢測(cè)機(jī)體B細(xì)胞BCR CDR3受體庫能發(fā)現(xiàn)其序列具單、寡克隆現(xiàn)象,能為疾病的預(yù)防和早期診斷提供重要信息[11];并且通過克隆情況可對(duì)機(jī)體腫瘤同源性進(jìn)行分析:對(duì)一淋巴瘤患者的B細(xì)胞BCR CDR3受體庫分析發(fā)現(xiàn)存在兩群非同源的B細(xì)胞克隆,后經(jīng)復(fù)雜的形態(tài)學(xué)和免疫組化等實(shí)驗(yàn)證實(shí)該患者確實(shí)患有兩種不同淋巴瘤。在自身免疫性疾病的應(yīng)用研究中Klarenbeek等[24]在最近的一次國際會(huì)議上,報(bào)告了用高通量測(cè)序T&B細(xì)胞CDR3受體庫在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制和診療上的研究價(jià)值和意義。隨研究的深入,將會(huì)發(fā)現(xiàn)更多基因多態(tài)性與疾病的關(guān)聯(lián);并且,更深入的對(duì)B細(xì)胞BCRCDR3受體庫進(jìn)行分析在觀察某些疾病治療效果方面也將成為很好的指標(biāo)。如通過分析造血干細(xì)胞移植前后BCR CDR3受體庫的大小及多樣性變化,能深入、準(zhǔn)確的監(jiān)測(cè)機(jī)體免疫重建狀況;某些B細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展存在障礙的個(gè)體用藥治療時(shí),通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)其BCR CDR3受體庫,可觀察該藥物的療效;某些疾病治療后仍有微小殘留病灶但無明顯表征,用常規(guī)方法不容易檢出,但可通過分析 BCR CDR3受體庫觀察到單、寡克隆擴(kuò)增。Boyd等[11]將454高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用到惡性疾病的評(píng)估、監(jiān)測(cè)疾病殘存病灶、不同年齡健康個(gè)體克隆多樣性分析等方面。如對(duì)治療后慢性淋巴細(xì)胞白血病患者B細(xì)胞受體庫用454高通量測(cè)序和克隆特異性實(shí)時(shí)PCR兩種方法進(jìn)行監(jiān)測(cè),以觀察是否存有微小殘余病灶,結(jié)果顯示兩種方法具有良好一致性;文中提出用454高通量測(cè)序僅需不到0.1 ml的血樣足以用于觀察機(jī)體多樣性克隆情況,并指出通過該種測(cè)序能清晰地監(jiān)測(cè)到B細(xì)胞受體庫中VDJ優(yōu)先重組情況,如在該次研究中即發(fā)現(xiàn)D2-2與J6、D3-22與J3、D3-3與J6等有優(yōu)先配對(duì)現(xiàn)象;文中還強(qiáng)調(diào)某些克隆比例增多,可能是機(jī)體對(duì)抗原的應(yīng)答反應(yīng),也可能是細(xì)胞惡化的前期標(biāo)志;在分析某些淋巴瘤(尤其是經(jīng)歷了高頻突變的毛囊瘤)的B細(xì)胞受體庫時(shí)要注意引物的設(shè)計(jì),以防影響結(jié)果。故監(jiān)測(cè)B細(xì)胞BCR CDR3受體庫的分析方法不失為應(yīng)用于臨床篩查、診斷疾病及觀察其治療療效并應(yīng)用于指導(dǎo)個(gè)性化治療等方面的簡便、靈敏、準(zhǔn)確的好方法。

4 小結(jié)

綜上所述,B細(xì)胞BCR CDR3受體庫隨著其監(jiān)測(cè)技術(shù)的進(jìn)步,容量和準(zhǔn)確度都在不斷提升、完善。分析機(jī)體B細(xì)胞BCR CDR3受體庫的應(yīng)用前景廣闊,貫穿生理和病理相關(guān)研究,為當(dāng)前某些無法解決的問題提供了新思路。如B細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的深入研究;某些疾病(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡)的發(fā)病機(jī)制及早期監(jiān)測(cè)與診斷的探討等。隨DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,Roche 454技術(shù)為B細(xì)胞BCR CDR3受體庫的分析應(yīng)用與研究建立了良好的技術(shù)平臺(tái)。相信隨著研究的深入,分析B細(xì)胞BCR CDR3受體庫的作用會(huì)日益凸顯,或?qū)?yīng)用于臨床疾病篩查、診斷、治療、藥物療效觀察等方面。

1 陳慰峰主編.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2004:36-36.

2 Wu Y C,Kipling D,Leong H S et al.High-throughput immunoglobulin repertoire analysisdistinguishesbetween human IgMmemory and switched memory B-cell populations[J].Blood,2010;116(7):1070-1078.

3 Glanville J,Zhai W,Berka J et al.Precise determination of the diversity of a combinatorial antibody library gives insight into the human immunoglobulin repertoire[J].Proc Natl Acad Sci,2009;106(48):20216-20221.

4 Boyd S D,Ga?ta B A,Jackson K J et al.Individual variation in the germline Ig gene repertoire inferred from variable region gene rearrangements[J].J Immunol,2010;184(12):6986-6992.

5 Gokmen E,Raaphorst FM,Boldt DH et al.Ig heavy chain third complementarity determining regions(H CDR3s)after stem cell transplantation do not resemble the developing human fetal H CDR3s in size distribution and Ig gene utilization[J].Blood,1998;92(8):2802-2814.

6 姚新生,馬 驪,溫 茜 et al.監(jiān)測(cè)TCRCDR3漂移的免疫掃描譜型分析技術(shù)的建立與鑒定[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2006;26(06):571-573.

7 Yin L,Kou Z C,RodriguezC et al.Antiretroviral therapy restores diversity in the T-cell receptor Vbeta repertoireof CD4 T-cell subpopulations among human immunodeficiency virus type 1-infected children and adolescents[J].Clin Vaccine Immunol,2009;16(9):1293-1301.

8 Weller S,Mamani-Matsuda M,Picard C et al.Somatic diversification in the absence of antigen-driven responses isthehallmark of the IgM+IgD+CD27+B cell repertoire in infants[J].JExp Med,2008;205(6):1331-1342.

9 N?sman-Bj?rk I,Lundkvist I.Oligoclonal dominance of immunoglobulin VH3 rearrangementsfollowing allogeneic bonemarrow transplantation[J].Bone Marrow Transplant,1998;21(12):1223-1230.

10 Wang X,Jia S,Meyer L et al.Quantitative measurement of pathogenspecific human memory T cell repertoire diversity using a CDR3 betaspecific microarray[J].BMCGenomics,2007;8:329-329.

11 Boyd S D,Marshall E L,Merker J D et al.Measurement and clinical monitoring of human lymphocyte clonality by massively parallel VDJpyrosequencing[J].Sci Transl Med,2009;1(12):12-23.

12 Ge X,Mazor Y,Hunicke-Smith SP et al.Rapid construction and characterization of synthetic antibody libraries without DNA amplification[J].Biotechnol Bioeng,2010;106(3):347-357.

13 Reddy ST,Ge X,Miklos A E et al.Monoclonal antibodies isolated without screening by analyzing the variable-gene repertoire of plasma cells[J].Nat Biotechnol,2010;28(9):965-969.

14 Wang C,Sanders CM,Yang Q et al.High throughput sequencing reveals a complex pattern of dynamic interrelationships among human T cell subsets[J].Proc Natl Acad Sci USA,2010;107(4):1518-1523.

15 Weinstein JA,Jiang N,White RA 3rd et al.High-throughput sequencing of the zebrafish antibody repertoire[J].Science,2009;324(5928):807-810.

16 Lee C E H,Jackson K J L,Sewell W A et al.Collins.Use of IGHJ and IGHD gene mutations in analysis of immunoglobulin sequences for the prognosis of chronic lymphocytic leukemia[J].Leuk Res,2007;31:1247-1252.

17 Robins H S,Srivastava S K,Campregher PV et al.Overlap and effective size of the human CD8+T cell receptor repertoire[J].Sci Transl Med,2010;2(47):47-64.

18 Cobaugh CW,Almagro JC,Pogson M et al.Synthetic antibody libraries focused towards peptide ligands[J].JMol Biol,2008;378(3):622-633.

19 Fellouse F A,Esaki K,Birtalan S et al.High throughput generation of synthetic antibodies from highly functional minimalist phage-displayed libraries[J].JMol Biol,2007;373(4):924-940.

20 Wrammert J,Smith K,Miller J et al.Rapid cloning of high-affinity human monoclonal antibodies against influenza virus[J].Nature,2008;453:667-671.

21 Meijer P J,Andersen P S,Haahr Hansen M et al.Isolation of human antibody repertoires with preservation of the natural heavy and light chain pairing[J].JMol Biol,2006;358:764-772.

22 Kwakkenbos M J,Diehl SA,Yasuda E et al.Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive humanmemory B cells by genetic programming[J].Nat Med,2010;16:123-128.

23 Mazor Y,Van Blarcom T,Mabry R et al.Isolation of engineered,fulllength antibodies from libraries expressed in Escherichia coli[J].Nat.Biotechnol,2007;25:563-565.

24 Klarenbeek P L,Doorenspleet M E,van Schaik B D C et al.Complete T and B cell receptor repertoire analysis in rheumatoid arthritis using high throughput sequencing[J].Ann Rheum Dis,2010;69:33-34.