孫大康 安新業(yè) 李 勐 周曉生 (濱州醫(yī)學院臨床學院,濱州256603)

目前在人類已發(fā)現(xiàn)70多種Trim(Tripartite motif,三基序)家族成員,其具有重要的抗病毒作用,并參與細胞的增殖、分化、腫瘤發(fā)生、凋亡及轉錄等方面的調節(jié)[1,2]。IFN(Interferon,干擾素)可以誘導Trim5α、Trim6、Trim 19、Trim21、Trim22 等多種Trim 蛋白在巨噬細胞或淋巴細胞的表達[3]。有意思的是,Trim22可以影響HIV-1病毒復制的多個環(huán)節(jié),抑制病毒顆粒的產(chǎn)生。HIV-1的gag基因產(chǎn)生55 kD的衣殼蛋白前體p55,p55由病毒編碼的一個蛋白酶切成四個小蛋白:MA(p17基質)、CA(p24衣殼)、NC(p9核衣殼)和p6。Trim22能與HIV的衣殼蛋白結合,抑制HIV病毒顆粒的形成[4]。在HIV感染細胞模型中過表達Trim22之后,發(fā)現(xiàn)HIV的衣殼蛋白彌散地分布于胞漿中,不能正常地定向轉移至細胞膜附近,從而抑制HIV的出芽過程[4]。目前雖然已有商品化的抗Trim22抗體,但抗體效價較低。同時,Trim家族成員之間同源性很高,用外源性Trim22全長蛋白作為抗原免疫動物,制備得到的抗體特異性并不理想。通過生物信息學分析,我們選取“382KSSGFAFDPSVNYSKV397”作為抗原表位,人工合成多肽與BSA偶聯(lián)后作為免疫原,制備抗Trim22多克隆抗體,這對于研究內源性Trim22與HIV-1衣殼蛋白及其前體相互作用的分子機制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料 HEK293T細胞株為本室保存;健康雄性新西蘭大白兔均由本院實驗動物中心提供;福氏佐劑購自Sigma公司;Lipofectamine、Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基購自Invitrogen公司;DMEM購自Gibco公司;FLAG鼠源單抗、抗人actin兔源多抗購自Sigma公司;HRP標記的二抗anti-rabbit IgG購自Southern Biotechnology Associates公司;HRP標記的二抗anti-mouse IgG購自R&D公司;硝酸纖維素膜(NC)購自BIO-RAD公司;ECLPlus購自Thermo公司,多肽由吉爾生化(上海)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 Trim22合成肽的設計 由Pubmed獲取Trim22氨基酸序列(Genbank登錄號:BC035582),利用lasergene7.0和Vector NTI Advance 11軟件分析,綜合各參數(shù)預測結果,確定382～397區(qū)段氨基酸作為抗原表位,合成多肽序列:KSSGFAFDPSVNYSKV。

1.2.2 Trim22合成肽與BSA的偶聯(lián) 將10 mg BSA溶于1.0 ml的pH8.0、50mmol/L的硼酸鈉鹽緩沖液中,加入5 mg的合成肽,將二者混勻。邊振蕩邊緩慢加入新鮮配制的0.15%戊二醛溶液1 ml,于室溫條件下溫和混勻2小時。加入0.25 ml的1 mol/L甘氨酸以封閉未反應的戊二醛。4℃下在4 L的pH 8.0、50 mmol/L的硼酸鈉鹽緩沖液中透析過夜。更換硼酸鈉鹽緩沖液后繼續(xù)透析4小時,儲存于4℃。

1.2.3 Trim22抗體的制備 取1 mg多肽-BSA交聯(lián)物溶于1 ml的PBS,與等量完全福氏佐劑充分乳化。每只兔子免疫接種1 ml乳濁液,在皮下多個位點接種,每個位點100～200μl。3周后,免疫原劑量同前,用不完全福氏佐劑充分乳化后,皮下多點注射。加強免疫共2次,間隔時間3周,經(jīng)耳緣靜脈采血測定抗體的效價,符合要求時,立即頸動脈取血。分離血清后,經(jīng)飽和硫酸銨沉淀法純化,分裝保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 間接ELISA法效價測定 用Trim22合成多肽(2 mg/L)包被 ELISA板,每孔加入 100μl,4℃過夜。用洗滌液洗3次后,加人1%gelatin室溫封閉2小時。甩干后,依次加入倍比稀釋的兔抗血清(37℃,孵育30分鐘,洗滌5次),然后加入1∶10 000的HRP-羊抗兔IgG孵育及洗滌。最后加TMB底物液顯色,終止反應后,讀取吸光值。

1.2.5 轉染 將Trim22、Trim22缺失突變體、Trim5α、Trim6和 Trim34α的 5′-Flag-pcDNA3.1(+)真核表達載體分別用 Lipofectamine轉染HEK293T細胞,抗Flag抗體能特異性識別Flag標簽。參照Invitrogen公司Protocol,具體操作如下:細胞在轉染20～24小時前種入24孔培養(yǎng)板中。當細胞匯合度達到約80%,將細胞培養(yǎng)液換成Opti-MEM無血清培液(200 μl/well)。用Opti-MEM無血清培液分別稀釋上述質粒DNA(0.4μg/well)和 Lipofectamine試劑(0.8μl/well),將兩者混合后,室溫放置30分鐘。將上述混合物加入細胞中,5小時后換為含血清的細胞培養(yǎng)液。

1.2.6 蛋白印跡鑒定抗體特異性 轉染24小時后收集細胞,用冷PBS洗一次,盡量棄去殘余的PBS;用適量體積預冷1×細胞裂解液(1.0%Nonidet P40,20 mmol/:Tris-HCl,pH8.0,10%(vol/vol)甘油,150 mmol/L NaCl,1 mmol/L NaF,2 mmol/L sodium orthovanadate,1 mmol/L sodium pyrophosphate and a protease inhibitor‘cocktail'Roche)。冰上放置15分鐘,充分裂解細胞。將細胞裂解液4℃11 372 r/min離心15分鐘,上清為獲取的細胞總蛋白。蛋白定量后,將同等總蛋白量的不同處理樣品進行8%～10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后,300 mA恒流轉移蛋白至硝酸纖維素膜;轉膜完畢后,用含5%脫脂奶粉的TBS(Tris-buffered saline)在室溫下封閉1小時。然后用TBST洗滌一次,加入抗Flag抗體或抗Trim22抗體,搖床孵育1小時。用TBST洗3次,每次5分鐘。加入HRP-二抗,搖床孵育1小時,用TBST洗3次,每次5分鐘。將等體積適量增強化學發(fā)光顯色液A液和B液混勻,覆蓋膜30秒～2分鐘,于暗室中曝光顯影。

2 結果

2.1 Trim22的B細胞抗原表位分析 通過進化樹分析及氨基酸序列比對,我們發(fā)現(xiàn)在Trim家族中Trim22、Trim5、Trim6、Trim34 的同源性很高,而且均可在干擾素或LPS刺激下誘導性表達[3]?！癡ector NTIAdvance 11”序列比對結果顯示,上述四種蛋白在氨基端和羧基端的相似性很高,僅在(340～350)及(380～400)區(qū)段存在明顯的序列差異(圖 1A、1B)。用Lasergene軟件,參照Jameson-Worf綜合預測方案進行分析。根據(jù)二級結構預測、親水性(Hydrophilicity)、可塑性(Flexible)、抗原指數(shù)(Antigenic index)及表面可及性(Accessibility)等指標,選擇(380-400)區(qū)段中多肽序列“KSSGFAFDPSVNYSKV”,作為Trim22的B細胞抗原表位(圖1C)。

2.2 效價測定 間接ELISA法檢測表明,抗Trim22抗體的效價為1∶16 000。

2.3 對外源性Trim22的識別 把表達載體5′-FlagpcDNA3.1(+)-Trim22經(jīng)Lipofectamine轉染HEK293T細胞,提取蛋白樣品進行蛋白印跡檢測。結果發(fā)現(xiàn):轉染Trim22組在約55 kD處有抗Trim22抗體特異性識別的蛋白條帶;轉染空質粒組對應位置無條帶顯示(圖2)。

2.4 對內源性Trim22的識別 干擾素刺激U937細胞后,提取蛋白樣品進行蛋白印跡檢測。結果發(fā)現(xiàn):干擾素刺激組在約55 kD處有抗Trim22抗體特異性識別的蛋白條帶,而未刺激組對應位置無條帶顯示(圖3)。

2.5 對Trim22缺失突變體的識別 把5′-Flag-pcDNA3.1(+)-Trim22(1-498)及其缺失突變體Trim22(61-498)、Trim22(132-498)、Trim22(1-282)表達載體經(jīng)Lipofectamine轉染HEK293T細胞,提取蛋白樣品進行蛋白印跡檢測。由于抗 Trim22抗體是針對(382-397)區(qū)段氨基酸序列設計,理論上該抗體可以識別包含該區(qū)段的Trim22缺失突變體。結果發(fā)現(xiàn):抗Trim22抗體可以識別Trim22(1-498)、Trim22(61-498)、Trim22(132-498)缺失突變體,卻不能識別Trim22(1-282)缺失突變體(圖4)。

圖1 Trim22的B細胞抗原表位分析Fig.1 The analysis result of Trim22 antigen epitope

圖2 檢測外源性Trim22的表達Fig.2 Detection of the exogenous Trim22 expression

圖3 檢測內源性Trim22的表達Fig.3 Detection of the endogenous Trim22 expression

圖4 抗Trim22抗體對Trim22缺失突變體的特異性識別分析Fig.4 Analysis of specificity of anti-Trim22Ab to Trim22 truncation mutant

圖5 抗Trim22抗體對Trim22旁系同源分子的識別Fig.5 Analysis of specificity of anti-Trim22Ab to Trim22 paralogous molecule

2.6 對Trim22旁系同源分子的識別 把5′-FlagpcDNA3.1(+)-Trim22及其旁系同源分子Trim5α、Trim6、Trim34α表 達 載 體 經(jīng) Lipofectamine轉 染HEK293T細胞,提取蛋白樣品進行蛋白印跡檢測。結果發(fā)現(xiàn):抗Flag抗體可以特異性識別質粒Trim5α(494aa)、Trim6(517aa)、Trim22(498aa)、Trim34α(488)表達的蛋白;抗Trim22抗體只能識別Trim22,無法識別質粒Trim5α、Trim6、Trim34α表達的蛋白(圖5)。

3 討論

Trim家族蛋白最顯著的特點是具有高度保守的RBCC結構域。Trim蛋白結構由三大部分組成:RING結構域、1～2個B-box結構域和Coiled-coil結構域,Trim家族也因此而得名[5]。在后生生物中,Trim家族蛋白均有表達,但不同種屬之間Trim分子的種類有一定的差異。譬如,在人的基因組中有70多個成員,在小鼠中有64個成員遠遠超過蠕蟲(20左右)和果蠅(小于10),由此說明Trim家族成員隨著物種的進化而不斷豐富[1]。

Trim22在抗HIV-1中的作用正引起人們的極大興趣,成為Trim5α之后新的研究熱點[6,7]。最初,人們發(fā)現(xiàn)在COS-7細胞中過表達Trim22,會抑制HIV-1長末端端重復序列相關報告基因的表達[8]。Ⅰ型、Ⅱ型IFN、LPS等均可誘導Trim22的表達[9]。在單核細胞來源的巨噬細胞中過表達Trim22,會抑制HIV-1的感染及復制。Trim22會導致感染細胞分泌的HIV-1衣殼蛋白下降,影響HIV-1生活周期晚期的病毒包裝或釋放過程[9]。最新研究發(fā)現(xiàn),與健康人相比HIV-1陽性患者外周血單個核細胞(PBMC)高表達IFN-β、MxA、Trim22,并且 Trim22 表達水平與HIV-1病毒載量呈負相關,與CD4+T細胞呈正相關[10]。體外實驗證明,HIV-1可以誘導健康人PBMC表達Trim22。在Jurkat細胞中抑制Trim22表達后,HIV-1病毒顆粒的釋放及復制顯著增強[10]。目前,尚不清楚Trim22通過何種機制影響HIV-1生活周期晚期的病毒包裝或釋放過程[11]。另外,Trim22還可以抑制其他多種類型的病毒。Trim22通過其E3泛素連接酶活性可以抵抗腦心肌炎病毒的感染;Trim22還作用于HBV病毒核心啟動子區(qū)域,抑制HBV的轉錄過程[12,13]。

Trim22包含氨基端的RBCC結構域(RING、B-box、Coiled-coil)和羧基端的B30.2結構域,大約有30多種Trim家族中成員具有這樣的組成形式。通過進化樹及序列比對分析,我們發(fā)現(xiàn)Trim22與Trim5α、Trim6、Trim34α的同源性很高。用“Vector NTI Advance 11”進行氨基酸序列比對,結果顯示:Trim22與Trim5α等在氨基端和羧基端都有很高的同源性。如果以Trim22兩端的序列設計多肽抗原,其雖然具有較好的表面可及性,但制備抗體的特異性可能受到較明顯的影響。

Trim22 與 Trim5α、Trim6、Trim34α的比對結果提示,在(380～400)區(qū)段存在明顯的序列差異。通過Lasergene軟件以“Chou Fasman”方案對Trim22的二級結構預測,在(380～400)區(qū)段無α螺旋和β片層結構,有β轉角結構。以“Gamier Robson”方案對Trim22的二級結構預測,在(380～400)區(qū)段無α螺旋,有β轉角結構及無規(guī)則卷曲結構。α螺旋、β片層結構規(guī)則,形態(tài)固定,一般不能作為抗原表位,β轉角結構或無規(guī)則卷曲結構為凸出結構,多出現(xiàn)在蛋白質抗原表面,利于與抗體嵌合,成為抗原表位的可能性大。進一步分析發(fā)現(xiàn)(380-400)區(qū)段還具有較好的親水性、可塑性、抗原指數(shù)及表面可及性,因此我們選擇“382KSSGFAFDPSVNYSKV397”合成多肽。由于多肽抗原普遍存在免疫原性較低的現(xiàn)象,通常這種激發(fā)作用比較弱,需要與載體蛋白偶聯(lián),以達到比較理想的免疫應答水平。通常根據(jù)免疫原性、溶解性以及是否能形成較多的偶聯(lián)基團,進行載體的選擇。多種不同種類的載體蛋白與多肽偶聯(lián)后可以作為良好的免疫原。目前最普遍使用的載體是匙孔戚血藍蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)和OVA(卵清白蛋白)。KLH的免疫原性最強,可偶聯(lián)的基團也較多,但它的溶解性較其他二者為差。本研究中采用Trim22合成肽與BSA偶聯(lián),作為抗原免疫動物。制備的兔源性抗Trim22抗體經(jīng)純化處理后,鑒定發(fā)現(xiàn):該抗體具有良好的效價,并且可以特異性識別包含該多肽序列的Trim22缺失突變體,而不能識別未包含該多肽序列的Trim22缺失突變體。同時,該抗體可以特異性識別Trim22,而無法識別Trim22旁系同源分子 Trim5α、Trim6、Trim34α載體表達的蛋白。上述結果均表明該兔源性抗Trim22抗體具有很好的特異性,并且該抗體可用于免疫共沉淀,檢測與內源性Trim22相互作用的靶蛋白(結果未顯示)。

綜上所述,通過本研究獲得了高效價的抗人Trim22多克隆抗體,該抗體可以特異性識別內源性及外源性Trim22蛋白,為我們進一步研究Trim22與HIV-1衣殼蛋白的相互作用機制奠定了基礎。

1 Ozato K,Shin DM,Chang T H et al.TRIM family proteins and their emerging roles in innate immunity[J].Nat Rev Immunol,2008;8(11):849-860.

2 McNab F W,Rajsbaum R,Stoye J P et al.Tripartite-motif proteins and innate immune regulation[J].Curr Opin Immunol,2010;23(1):46-56.

3 Carthagena L,Bergamaschi A,Luna JM et al.Human TRIM geneexpression in response to interferons[J].PLoS One,2009;4(3):e4894.

4 Barr SD,Smiley J R,Bushman F D.Theinterferon response inhibits HIV particle production by induction of TRIM22[J].PLoS Pathog,2008;4(2):e10000072.

5 Nisole S,Stoye J P,Saib A.TRIM family proteins:retroviral restriction and antiviral defence[J].Nat Rev Microbiol,2005;3(10):799-808.

6 Stremlau M,Owens CM,Perron M J et al.The cytoplasmic body component TRIM5alpharestricts HIV-1 infection in Old World monkeys[J].Nature,2004;427(6977):848-853.

7 高 波,段志堅,徐 薇 et al.固有免疫分子TRIM5α對乙型肝炎病毒復制的影響[J].中國免疫學雜志,2009;25(7):601-605.

8 Tissot C,Mechti N.Molecular cloning of a new interferon-induced factor that represses human immunodeficiency virus type 1 long terminal repeat expression[J].J Biol Chem,1995;270(25):14891-14898.

9 Bouazzaoui A,Kreutz M,Eisert V et al.Stimulated trans-acting factor of 50 kDa(Staf50)inhibits HIV-1 replication in human monocyte-derived macrophages[J].Virology,2006;356(1-2):79-94.

10 Singh R,Gaiha G,Werner L et al.Association of TRIM22 with the type 1 interferon response and viral control during primary HIV-1 infection[J].JVirol,2011;85(1):208-216.

11 Kajaste-Rudnitski A,Pultrone C,Marzetta F et al.Restriction factors of retroviral replication:the example of Tripartite Motif(TRIM)protein 5 alpha and 22[J].Amino Acids,2010;39(1):1-9.

12 Eldin P,Papon L,Oteiza A et al.TRIM22 E3 ubiquitin ligase activity is required to mediate antiviral activity against encephalomyocarditis virus[J].JGen Virol,2009;90(Pt 3):536-545.

13 Gao B,Duan Z,Xu W et al.Tripartite motif-containing 22 inhibits the activity of hepatitis B virus core promoter,which is dependent on nuclear-located RING domain[J].Hepatology,2009;50(2):424-433.