朱思思 趙肅清 李月明 溫俊林 (廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院,廣州510006)

腸道病毒71型是細(xì)小RNA病毒科,腸道病毒屬,自1974年首次報(bào)道以來(lái),已在全世界范圍內(nèi)多次爆發(fā)和流行[1,2]。EV71感染除了能引起手足口病(Hand-foot-and-mouth disease,HFMD)外,還能引起一系列神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的嚴(yán)重疾病如腦干腦炎、無(wú)菌性腦膜炎和脊髓灰質(zhì)炎樣的麻痹[3]。然而目前針對(duì)腸道病毒EV71感染仍沒(méi)有有效的預(yù)防疫苗及治療特效藥。近年來(lái),卵黃抗體(egg yolk immunoglobulin Y,IgY)因其具有經(jīng)濟(jì)、安全、制備方便、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)而成為當(dāng)今生物科學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)[4]。IgY抗體在動(dòng)物與人的被動(dòng)免疫保護(hù)方面的應(yīng)用引起了廣泛的關(guān)注。國(guó)內(nèi)外已有一些關(guān)于抗豬繁殖與呼吸綜合癥病毒、抗流感病毒、抗甲肝病毒IgY抗體的研究報(bào)道[5-7]。本研究的目的在于制備與鑒定特異性抗EV71病毒的IgY抗體并檢測(cè)其生物學(xué)性能,為EV71感染手足口病的預(yù)防和治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑 高速冷凍離心Allegra TM 64R Centrifuge(Beckman,America);酶標(biāo)分析儀Tecan infinite 200(Tecan,Switzerland);生物安全柜NE-430-600E(NUAIRE,America);真空冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司);HRP標(biāo)記山羊抗雞IgY二抗為Promega公司產(chǎn)品;弗氏佐劑(Freund's adjuvant)、四甲基聯(lián)苯胺(Tetrabenzidine,TMB)購(gòu)自Sigma公司;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基均為Gibco公司產(chǎn)品;CsCl為MERCK公司產(chǎn)品;PEG6000為日產(chǎn)購(gòu)自廣東國(guó)奧生物科技公司;其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 廣州太和良田養(yǎng)雞場(chǎng)健康產(chǎn)蛋母雞4只,未經(jīng)任何免疫,正常飼養(yǎng)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)抗原 EV71腸道病毒廣東惠州株由廣東省疾病預(yù)防控制中心提供。

1.2 方法

1.2.1 抗原的純化 將EV71病毒株接種到生長(zhǎng)至單層的橫紋肌肉瘤細(xì)胞RD細(xì)胞中,CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至90%左右細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變CPE時(shí)收獲,-20℃凍融3次,4℃,10 000 r/min離心90分鐘,收集上清液。上清液經(jīng)4℃,26 000 r/min離心3小時(shí),棄上清,沉淀用PBS緩沖液懸浮。CsCl密度梯度離心,4℃45 000 r/min離心3小時(shí),棄上清去除殘余CsCl,加入少量PBS稀釋純化后病毒液,56℃高溫滅活,4℃保存。

1.2.2 免疫方法 取純化后的EV71病毒原液與弗氏完全佐劑等體積混合,乳化充分后按200μl/只的抗原量經(jīng)肌肉多點(diǎn)注射免疫實(shí)驗(yàn)雞;然后分別在一免后14、24、34天分別進(jìn)行三次加強(qiáng)免疫,加強(qiáng)免疫用弗氏不完全佐劑與病毒液等體積乳化,免疫方法和劑量與首免相同。首免后第7天開(kāi)始收集每日雞蛋,編號(hào)4℃冰箱保存?zhèn)溆?。收集免疫前雞蛋及血清為陰性對(duì)照。

1.2.3 卵黃抗體的分離純化 將收集的雞蛋破殼,收集蛋黃并在無(wú)菌定性濾紙上滾動(dòng)以除去殘留卵白蛋白,破卵黃膜收集卵黃液,測(cè)卵黃液體積并平分兩份,提取純化方法分別采用PEG三步沉淀法及本實(shí)驗(yàn)室改良的水提綜合PEG法純化蛋白[8]:加卵黃液9倍體。積的4℃凍存蒸餾水,調(diào)pH值至5.2,充分?jǐn)噭蚝蠓?℃靜置過(guò)夜。4℃,10 000 r/min離心20分鐘,過(guò)濾,棄沉淀。上清液中加入PEG6000粉末使其終濃度為8.5%,調(diào)pH值至7.2,充分混勻后4℃,10 000 r/min離心20分鐘,棄上清液。沉淀用適量4℃PBS緩沖液(0.01 mol/L,pH7.2)溶解后再加入PEG6000至終濃度為12%,10 000 r/min,4℃離心20分鐘,棄上清。再用少量PBS溶解沉淀,轉(zhuǎn)入透析袋(分子截留量14 kD),透析24小時(shí)以上,收集透析液,-56℃真空冷凍干燥至粉末,-20℃保存。

1.2.4 卵黃抗體純度及含量檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[9]用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定IgY純化后凍干粉中總蛋白含量。還原性SDS-PAGE凝膠電泳(5%濃縮膠、15%分離膠)分析IgY的純度,凝膠成效掃描分析計(jì)算總蛋白中IgY含量。

1.2.5 間接ELISA法檢測(cè)卵黃抗體效價(jià) 將純化過(guò)的EV71病毒抗原用0.01 mol/LPBS1∶1 000稀釋后包被于96孔酶標(biāo)板上(100μl/孔),37℃溫浴1小時(shí)后,4℃過(guò)夜。用含3%脫脂奶粉的0.01 mol/L PBS液封閉(100μl/孔),37℃溫浴1小時(shí)。卵黃抗體IgY用0.01 mol/L PBS倍比系列稀釋后加入96孔酶標(biāo)板(100μl/孔),37℃溫浴反應(yīng)1小時(shí)后加入酶標(biāo)二抗HRP-GAM IgY(100μl/孔),37℃溫浴 1小時(shí)。用TMB顯色液顯色約15分鐘后2 mol/LH2SO4溶液終止反應(yīng)(50μl/孔),立即用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450nm處吸光值。以免疫雞IgY與未免疫雞陰性IgY OD450nm吸光值之比大于2.1,且陰性IgY吸光值大于0.1作為抗體陽(yáng)性的判定閥值。

1.2.6 免疫雙向瓊脂擴(kuò)散檢測(cè) 瓊脂糖與PEG6000各1 g溶于100 ml生理鹽水,煮沸至透明,趁熱倒入潔凈培養(yǎng)皿中,每平皿約18～20 ml,加蓋置平臺(tái)。待其冷卻凝固后用打梅花樣孔,孔徑約4 mm,孔距約3 mm。用針頭小心挑出孔內(nèi)瓊脂糖,封閉孔底。

往中心孔加入一定量抗原原液,外周孔加入等量不同稀釋倍數(shù)的抗體IgY溶液。靜置至孔內(nèi)樣液完全吸入瓊脂中,將培養(yǎng)皿倒置平放于濕盒內(nèi),37℃恒溫水浴,24～48小時(shí)后觀察結(jié)果。

1.2.7 免疫印跡(Western blot)分析卵黃抗體的特異性 將SDS-PAGE凝膠電泳分離的EV71病毒蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜,室溫下以含5%脫脂奶粉的TBST為封閉液,純化IgY為一抗,HRP標(biāo)記山羊抗雞IgY為二抗,增敏二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液顯色。同時(shí)設(shè)定陰性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 IgY的提取 BSA的Bradford法標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1,得蛋白濃度計(jì)算公式Y(jié)=0.008 3X+0.036,R2=0.990 5。計(jì)算得水提綜合PEG法和PEG三步沉淀法兩種不同提取方法提取的凍干粉中蛋白含量分別為89.64%、85.90%。

由SDS-PAGE電泳結(jié)果(圖2)可見(jiàn)目的蛋白在還原條件下二硫鍵打開(kāi),分裂約64 kD的IgY重鏈和26 kD的IgY輕鏈。WSF中含有大量雜蛋白;經(jīng)3.5%和8.5%PEG兩步沉淀法提取的沉淀蛋白中仍含有一定量40 kD的β活性蛋白;而由水提綜合PEG法、PEG三步沉淀法提取蛋白中雜蛋白大量減少,IgY純度顯著提高,凝膠成像系統(tǒng)軟件分析IgY抗體純度分別為94.86%和92.56%。同時(shí)由表1可知,水提綜合PEG法提取IgY產(chǎn)量達(dá)7.76 mg/ml,而PEG三步沉淀法提取IgY產(chǎn)量?jī)H為3.96 mg/ml。

2.2 ELISA檢測(cè)IgY效價(jià)及消長(zhǎng)規(guī)律 抗EV71病毒IgY抗體ELISA檢測(cè)效價(jià)變化規(guī)律如圖3。蛋雞初免約10天后蛋黃中可檢測(cè)到特異性卵黃抗體,加強(qiáng)免疫后特異性IgY效價(jià)呈明顯的增長(zhǎng)趨勢(shì)。初免約40天后抗體效價(jià)達(dá)最高1∶20 480,此高效價(jià)大約維持30天后抗體效價(jià)水平開(kāi)始逐步下降。

2.3 免疫雙向瓊脂擴(kuò)散 以雙向免疫瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)初免后第40天特異性抗EV71病毒IgY抗體效價(jià)。結(jié)果如圖4,當(dāng)抗體以1∶16稀釋時(shí),抗原孔與抗體孔之間仍出現(xiàn)顯著白色沉淀線,而PBS空白對(duì)照孔與抗原孔之間無(wú)沉淀線。

2.4 Western blot分析 抗EV71病毒IgY Western blot分析結(jié)果(如圖5)顯示能特異性地與EV71病毒蛋白條帶產(chǎn)生良好免疫反應(yīng)。如圖5所示抗EV71病毒IgY與EV71病毒蛋白在約38、36、24 kD出現(xiàn)特異性結(jié)果條帶,由文獻(xiàn)[10]可知,相對(duì)分子量為36、24 kD左右的蛋白條帶分別為EV71病毒的VP1(α)、VP3蛋白。而陰性IgY與EV71病毒不具有免疫反應(yīng)性,圖中沒(méi)有特異性結(jié)合的蛋白條帶出現(xiàn)。

表1 兩種提取方法提取卵黃抗體產(chǎn)量及純度對(duì)比表Tab.1 Comparetheyield and purity of IgY extracted by PEG method and Water-PEG method

圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve of protein

圖2 純化IgY的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE patterns of IgY purified by three methods

圖3 抗EV71病毒IgY抗體效價(jià)消長(zhǎng)規(guī)律Fig.3 The development pattern of anti-EV71 IgY after primary immunization

圖4 雙向免疫瓊脂擴(kuò)散Fig.4 Agar double immunodiffusion

圖5 蛋白印跡分析抗EV71病毒IgYFig.5 Western blot analysis the immunoreactivity of IgY anti-EV71

3 討論

目前,提取IgY常用方法主要有水提硫酸銨沉淀法、PEG三步沉淀法等[11]。水提硫酸銨沉淀法獲得卵黃抗體的產(chǎn)量大,純度高,但實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng),硫酸銨消耗量大,成本高,不適合實(shí)驗(yàn)室小型研究;而PEG三步沉淀法雖實(shí)驗(yàn)周期短,但提取IgY產(chǎn)量低,浪費(fèi)嚴(yán)重。本研究采用綜合以上兩種提取方法的水提綜合PEG法,并成功獲得抗EV71的特異性IgY抗體,操作步驟簡(jiǎn)便快捷,實(shí)驗(yàn)成本低、周期短,得到的卵黃抗體純度高達(dá)94.83%,產(chǎn)量達(dá)7.76 mg/ml,明顯高于PEG三步沉淀法得92.56%和3.96 mg/ml。

EV71病毒顆粒為二十面體立體對(duì)稱(chēng)的球形結(jié)構(gòu),直徑約24～30 nm,病毒顆粒的衣殼組成非常復(fù)雜,分子量分別為34、30、26和7 kD的四種結(jié)構(gòu)蛋白VP1(α)、VP2(β)、VP3(γ)、VP4(δ)中,除 VP4 包埋在病毒粒子外殼的內(nèi)側(cè)與病毒核心緊密連接以外,其他三種結(jié)構(gòu)蛋白均暴露在病毒顆粒的表面,因而抗原決定簇基本上位于VP1-VP3上[10]。本研究Western blot分析顯示相對(duì)分子量為36、24 kD左右的蛋白條帶分別為純化EV71病毒的VP1、VP3蛋白。

EV71病毒顆粒沒(méi)有類(lèi)脂性的包膜,對(duì)一般去污劑、75%乙醇、5%甲酚皂溶液等常見(jiàn)消毒液等具有抵抗力,這些都決定了該病毒較強(qiáng)的野外生存能力[12,13]。EV71病毒耐酸、耐熱,極易在濕熱環(huán)境下傳播繁殖,然而對(duì)高溫(50℃以上)及紫外線的抵抗能力較差。以EV71病毒為常見(jiàn)病原體的手足口病是一種全球性的傳染病,其在世界范圍內(nèi)的傳播流行給社會(huì)造成了極大的恐慌。如今預(yù)防EV71感染的疫苗還在研制中,同時(shí)仍沒(méi)有治療由EV71感染所致疾病的特效藥物。近年來(lái),IgY在診斷和治療應(yīng)用方面的研究在國(guó)內(nèi)外都已經(jīng)取得了積極的成果。Wang等[14]研究表明證明了抗金黃色葡萄球菌的卵黃抗體對(duì)乳腺炎有治療作用;葉翠蓮等[15]也報(bào)道了抗幽門(mén)螺桿菌卵黃抗體對(duì)幽門(mén)螺桿菌感染具有較好治療效果。本研究利用滅活病毒免疫蛋雞所獲得的抗EV71病毒IgY抗體ELISA檢測(cè)效價(jià)達(dá)1∶20 480,具有良好的免疫反應(yīng)性,相對(duì)于傳統(tǒng)的哺乳動(dòng)物抗體制備具有制備簡(jiǎn)單、成本低、無(wú)需殺害動(dòng)物等優(yōu)點(diǎn),為預(yù)防和治療抗EV71藥物提供了基礎(chǔ)。同時(shí),可再深入通過(guò)體外中和活病毒實(shí)驗(yàn)和抗EV71動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)檢測(cè)該特異性抗EV71 IgY體內(nèi)外抗病毒的能力。因卵黃抗體安全衛(wèi)生,穩(wěn)定性好,不易被胰蛋白酶、胃蛋白酶水解失活[16],因此,可通過(guò)向飲料及洗手液等產(chǎn)品中添加該特異性抗EV71 IgY,來(lái)達(dá)到預(yù)防及治療EV71感染。

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