張明峰 周守勤 劉淑霞 彭晨星 郭惠芳 (河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院免疫風(fēng)濕科,石家莊050000)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種高度致殘性疾病。采取有效措施控制滑膜組織增生是改善預(yù)后,延長(zhǎng)患者壽命的關(guān)鍵所在。積極探索療效可靠、毒副作用小、經(jīng)濟(jì)適用的緩解病情藥物,也成為了各風(fēng)濕病學(xué)者研究的重點(diǎn)課題之一。三氧化二砷(As2O3)在急性白血病和各類(lèi)實(shí)體瘤的治療中已取得了舉世矚目的成就,并已經(jīng)應(yīng)用于臨床[1,2]。但其對(duì)風(fēng)濕性疾病的治療作用仍在探索之中。前期體外細(xì)胞培養(yǎng)研究顯示,As2O3可通過(guò)抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子(Signal transducer and activator of transcription,STAT)1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,抑制高遷移率族蛋白1誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞增殖[3]。本研究借助膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(Collagen-induced arthritis,CIA)大鼠模型進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步探討As2O3對(duì)滑膜增殖的抑制作用,以及對(duì)STAT和細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制蛋白(Suppressor of cytokine signaling,SOCS)信號(hào)通路的影響,為將來(lái)As2O3應(yīng)用于臨床提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 As2O3(黑龍江伊達(dá)藥業(yè)公司生產(chǎn));兔抗大鼠p-STAT1、p-STAT3單克隆抗體(Cell Signaling公司);SOCS1、SOCS3多克隆抗體、羊抗大鼠FITC-IgG二抗(Santa Cruz);小鼠抗大鼠PCNA單克隆抗體(北京中山生物工程公司),破膜劑(美國(guó)eBioscience公司);牛Ⅱ型膠原(美國(guó)Sigma公司);弗氏完全佐劑(美國(guó)Sigma公司);卡介苗(上海生物制品研究所);免疫組織化學(xué)SP試劑盒(生物晶美公司);Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter);光學(xué)顯微鏡(日本Olympus)。

1.2 動(dòng)物模型制備及分組

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Wistar大鼠42只,8～12周齡,體重(160±20)克,購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,清潔級(jí)動(dòng)物室內(nèi)養(yǎng)殖,室內(nèi)定期進(jìn)行紫外線照射,所用飼料、水及用具均經(jīng)定期滅菌處理。室溫控制在18～25℃,相對(duì)濕度20%～30%。

1.2.2 Ⅱ型膠原乳劑的制備[4]將Ⅱ型膠原溶于0.1 mol/L的醋酸中,在4℃下攪拌充分溶解,濃度為2 mg/ml,置4℃冰箱過(guò)夜。再與完全弗氏佐劑等體積混合,冰浴下用玻璃攪拌器勻速攪拌,至充分乳化,即乳化液滴入水中無(wú)消散,制成Ⅱ型膠原乳劑。

1.2.3 造模方法及分組 將42只Wistar大鼠隨機(jī)分成五組,Ⅰ組為正常對(duì)照組6只,Ⅱ～Ⅴ組每組各9只用于造模,Ⅱ組為模型對(duì)照組,Ⅲ～Ⅴ組分別為低、中、高劑量As2O3治療組。適應(yīng)性喂養(yǎng)7天,第8天進(jìn)行造模。每只大鼠的尾根部及背部多點(diǎn)皮內(nèi)注射Ⅱ型膠原乳劑0.2ml初次免疫,第21天腹腔注射乳劑0.2 ml作為二次免疫,第22天開(kāi)始,對(duì)Ⅱ～Ⅴ組大鼠進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分[5],當(dāng)總評(píng)分大于2分時(shí),陸續(xù)開(kāi)始干預(yù)治療,每組給藥6只,其余剔除,造模成功率約70%～80%。采用腹腔注射給藥方法,連續(xù)28天。Ⅰ、Ⅱ組給予等體積的生理鹽水,Ⅲ組:1.0 mg/(kg?d)As2O3治療,Ⅳ組:2.0 mg/(kg?d)As2O3治療,Ⅴ組:4.0 mg/(kg?d)As2O3治療。腹腔給藥容量均為20 mg/kg。

1.3 關(guān)節(jié)標(biāo)本采集及制作 第50天股動(dòng)脈取血處死所有大鼠,完整剝離滑膜組織,一并取后肢踝、趾關(guān)節(jié),充分剃去皮毛及肌腱組織,浸泡于4%的多聚甲醛中固定48小時(shí)后,浸于20%EDTA脫鈣液中,室溫脫鈣,時(shí)間3～4周。由踝關(guān)節(jié)中間縱行剖開(kāi),一半用于流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè),一半用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)。后者和滑膜組織(固定24小時(shí))標(biāo)本均按常規(guī)程序,脫水、透明、石蠟包埋,切片 4μm,貼于經(jīng)多聚賴氨酸處理過(guò)的載玻片上,60℃烤片,48小時(shí)備用。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)關(guān)節(jié)組織中PCNA蛋白的表達(dá) 切片厚4μm,常規(guī)脫蠟水化,一抗為小鼠抗大鼠PCNA抗體(1∶100稀釋),二抗分別為與一抗相對(duì)應(yīng)的生物素化IgG(1∶100稀釋),以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照,DAB顯色,光鏡觀察陽(yáng)性信號(hào)。具體步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)關(guān)節(jié)組織中PCNA、p-STAT 1/3、SOCS1/3蛋白的表達(dá) 將標(biāo)本用網(wǎng)搓法制成單細(xì)胞懸液,取單細(xì)胞懸液 1×106ml-1,加入破膜劑,輕微震蕩,孵育15分鐘,離心棄上清;分別加入PCNA、p-STAT1/3、SOCS1/3抗體 100 μl(PCNA 抗體 1∶100稀釋,p-STAT1/3、SOCS1/3抗體為 1∶50稀釋),室溫孵育30分鐘,PBS洗滌后加入1∶50羊抗大鼠FITCIgG二抗工作液100μl,避光室溫孵育30分鐘,PBS洗滌后,在Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。設(shè)PBS代替一抗和二抗的陰性對(duì)照,以及只加一抗或二抗的陽(yáng)性對(duì)照和同型對(duì)照。以熒光指數(shù)(FI)表示待測(cè)蛋白的相對(duì)含量,公式:FI=(樣品蛋白表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度-對(duì)照樣品平均熒光強(qiáng)度)/正常對(duì)照樣品平均熒光強(qiáng)度。

1.6 結(jié)果判定及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):PCNA蛋白陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi),呈棕黃色顆粒者為陽(yáng)性。計(jì)量資料以±s表示,采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行 t檢驗(yàn)、單因素方差(One-Way ANOVA)分析及Spearman相關(guān)分析,P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 As2O3對(duì)大鼠關(guān)節(jié)炎的治療作用 與模型組相比,低、中、高劑量As2O3組關(guān)節(jié)炎指數(shù)呈劑量依賴性下降(P＜0.01),分別為8.75±1.25、6.19±1.27、3.86±0.44和3.23±0.51;中、高劑量顯著優(yōu)于低劑量組(P＜0.01),見(jiàn)圖1。

2.2 As2O3對(duì)關(guān)節(jié)組織PCNA蛋白表達(dá)的影響 免疫組織化學(xué)顯示:正常對(duì)照組,滑膜襯里層散在滑膜細(xì)胞的胞核內(nèi)可見(jiàn)棕黃色陽(yáng)性顆粒,軟骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞均呈陰性表達(dá);模型組可見(jiàn)大量PCNA蛋白表達(dá)陽(yáng)性的滑膜細(xì)胞覆蓋于軟骨表面,并向軟骨下侵蝕,浸潤(rùn)的炎細(xì)胞胞核內(nèi)可見(jiàn)棕黃色顆粒,少數(shù)受損的軟骨細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)淡黃色陽(yáng)性顆粒。隨著As2O3治療劑量的增加PCNA蛋白陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)目明顯減少(圖2)。

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:模型組PCNA蛋白表達(dá)顯著增加,與正常對(duì)照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);As2O3治療后,CIA大鼠關(guān)節(jié)組織中PCNA蛋白表達(dá)顯著下降,接近正常水平(P＜0.01,表1)。

2.3 As2O3對(duì)關(guān)節(jié)組織p-STAT1蛋白表達(dá)的影響 模型組關(guān)節(jié)組織中p-STAT1表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.01);低、中劑量As2O3治療4周,p-STAT1蛋白表達(dá)較模型組明顯下降(P＜0.01和 P＜0.05),但仍高于正常對(duì)照組(圖3、表1)。

圖1 As2O3對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響Fig.1 The effect of As2O3 on MAI of CIA rats in different dose groug

圖2 As2O3對(duì) CIA大鼠滑膜組織中PCNA蛋白表達(dá)的影響(IHC,×400)Fig.2 The expression of PCNA protein in the synovium detected by IHC(×400)

圖3 FCM檢測(cè)AS2O3對(duì)滑膜組織中p-STAT1蛋白的表達(dá)的影響Fig.3 Histogram of p-STAT1 protein expression in the synovium detected by FCM

表1 As2O3對(duì) CIA大鼠關(guān)節(jié)組織中PCNA、p-STAT1/SOCS1,p-STAT3/SOCS3蛋白表達(dá)的影響(±s,n=6)Tab.1 The effect of As2O3 on theexpression of PCNA,p-STAT1/SOCS1,p-STAT3/SOCS3 proteins of CIA rats articular tissues by FCM( ±s,n=6)

表1 As2O3對(duì) CIA大鼠關(guān)節(jié)組織中PCNA、p-STAT1/SOCS1,p-STAT3/SOCS3蛋白表達(dá)的影響(±s,n=6)Tab.1 The effect of As2O3 on theexpression of PCNA,p-STAT1/SOCS1,p-STAT3/SOCS3 proteins of CIA rats articular tissues by FCM( ±s,n=6)

Note:One-Way ANOVA,1)P＜0.05,2)P＜0.01 vs normal control group;3)P＜0.05,4)P＜0.01 vsmodel control group.

Group PCNA p-STAT1 SOCS1 p-STAT3 SOCS3 Normal control 1.00±0.16 1.00±0.09 1.00±0.08 1.00±0.08 1.00±0.18 Model control 1.26±0.032) 1.27±0.082) 1.18±0.052) 1.27±0.112) 1.24±0.072)As2O3 treated group Low-dose group 1.10±0.104) 1.06±0.084) 1.12±0.031)3) 1.16±0.022)3) 1.18±0.041)Mid-dose group 0.99±0.054) 1.15±0.062)3) 1.17±0.112) 1.19±0.052) 1.21±0.08 High-dose group 1.04±0.094) 1.33±0.122) 1.23±0.102) 1.23±0.092) 1.20±0.111)

圖4 FCM檢測(cè)AS2O3對(duì)滑膜組織中SOCS1蛋白的表達(dá)的影響Fig.4 Histogram of SOCS1 protein expression in the synovium detected by FCM

2.4 As2O3對(duì)關(guān)節(jié)組織SOCS1蛋白表達(dá)的影響 模型組關(guān)節(jié)組織中SOCS1表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.01);與模型組相比,低劑量組SOCS1蛋白表達(dá)減少(P＜0.05),而劑量達(dá) 4 mg/(kg?d)后,SOCS1蛋白表達(dá)增加,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4、表1)。

圖5 FCM檢測(cè)AS2O3對(duì)滑膜組織中p-STAT3蛋白的表達(dá)的影響Fig.5 Histogram of p-STAT3 protein expression in thesynovium detected by FCM

2.5 As2O3對(duì)關(guān)節(jié)組織p-STAT3蛋白表達(dá)的影響 模型組關(guān)節(jié)組織中p-STAT3表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.01);低劑量As2O3治療4周,p-STAT3蛋白表達(dá)較模型組下降(P＜0.05),但仍高于正常對(duì)照組,而中、高劑量組蛋白表達(dá)變化與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5、表1)。

2.6 As2O3對(duì)關(guān)節(jié)組織SOCS3蛋白表達(dá)的影響 模型組關(guān)節(jié)組織中SOCS3表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.01);不同劑量As2O3治療組中,SOCS3蛋白表達(dá)量較模型組下降,但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6、表1)。

圖6 FCM檢測(cè)AS2O3對(duì)滑膜組織中SOCS3蛋白的表達(dá)的影響Fig.6 Histogram of SOCS3 protein expression in the synovium detected by FCM

2.7 相關(guān)性分析 低As2O3治療CIA大鼠4周時(shí),p-STAT1/3蛋白表達(dá)與PCNA表達(dá)成正相關(guān),(r=0.413,P=0.045;r=0.427,P=0.023);高劑量治療4周時(shí),p-STAT1/3蛋白表達(dá)與PCNA表達(dá)無(wú)相關(guān)性,(r=0.252,P=0.179,r=0.313,P=0.116)。

3 討論

CIA大鼠是目前研究RA發(fā)病機(jī)制運(yùn)用較多的動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)采用Wistar大鼠,通過(guò)牛Ⅱ型膠原聯(lián)合弗氏完全佐劑誘發(fā)免疫反應(yīng),成功誘導(dǎo)了CIA動(dòng)物模型,造模成功率在70%以上?；诎籽『湍[瘤性疾病的研究成果,近年來(lái),部分風(fēng)濕病學(xué)者以As2O3治療實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎[6,7],結(jié)果顯示As2O3可以通過(guò)抑制滑膜細(xì)胞分化,誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞凋亡,但As2O3的作用機(jī)制尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)首先應(yīng)用免疫組織化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)兩種方法,從定位和半定量的角度探討了反映細(xì)胞增殖的標(biāo)記物——增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)情況,模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表面、軟骨下骨組織內(nèi)均可見(jiàn)大量PCNA蛋白表達(dá)陽(yáng)性的滑膜細(xì)胞浸潤(rùn),同時(shí)炎細(xì)胞增生也顯著增加,提示模型組大鼠滑膜組織已經(jīng)出現(xiàn)高度侵蝕性增生。As2O3治療后,PCNA蛋白在浸潤(rùn)的炎細(xì)胞、滑膜細(xì)胞中的表達(dá)均下降,說(shuō)明As2O3能夠顯著抑制包括滑膜細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞的增殖。

STAT是一種能與靶基因調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合的胞質(zhì)蛋白家族,在人和哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)7個(gè)STAT家族成員 :STAT 1 ～4 、STAT 5a、STAT 5b、STAT 6,能夠介導(dǎo)多種細(xì)胞因子調(diào)控的細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖及凋亡過(guò)程[8]。STATs作為轉(zhuǎn)錄因子在沒(méi)有特異性的刺激時(shí)定位于胞質(zhì)內(nèi),當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí),STATs上的SH2結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞膜受體中被磷酸化的酪氨酸殘基結(jié)合,同時(shí)自身發(fā)生磷酸化并迅速形成同源或異源二聚體,轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi),與啟動(dòng)子結(jié)合,調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄,完成細(xì)胞因子受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),調(diào)節(jié)機(jī)體的天然免疫及獲得性免疫應(yīng)答反應(yīng)。目前已知,STAT1和STAT3與RA滑膜炎嚴(yán)重程度密切相關(guān)。本研究結(jié)果也顯示,模型組關(guān)節(jié)組織中p-STAT1/3表達(dá)顯著增高,低劑量As2O3治療4周,p-STAT1/3蛋白表達(dá)較模型組明顯下降,并與PCNA表達(dá)呈正相關(guān),而高劑量組其表達(dá)量有增加趨勢(shì),說(shuō)明低劑量具有抑制滑膜細(xì)胞增殖的作用,而高劑量可能具有促進(jìn)增殖的作用。既往研究也顯示,4.0 mg/kg/d和6.0 mg/kg/d的As2O3治療CIA大鼠兩周,電鏡下觀察發(fā)現(xiàn),關(guān)節(jié)A型滑膜細(xì)胞減少,B型滑膜細(xì)胞增加[9]。因此,As2O3治療劑量和療程的選擇尚需進(jìn)一步探討。

細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制蛋白(Suppressor of cytokine signaling,SOCS)家族是一類(lèi)由細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生并反饋性阻斷細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的負(fù)性調(diào)節(jié)因子,參與多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和激素的信號(hào)調(diào)節(jié),對(duì)于維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著重要的內(nèi)源性調(diào)節(jié)作用[10,11]。SOCS通過(guò)與STAT競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合細(xì)胞因子受體的酪氨酸磷酸化位點(diǎn),對(duì)Janus激酶/STAT信號(hào)通路進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié),減少多種細(xì)胞因子受體的表達(dá)而抑制細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)傳遞。SOCS1是最早被發(fā)現(xiàn)的SOCS家族成員之一,SOCS1是STAT1的特異性內(nèi)源性抑制劑。本研究發(fā)現(xiàn),模型組p-STAT1的活性增強(qiáng)反饋性引起SOCS1表達(dá)增強(qiáng),低劑量As2O3干預(yù)治療后,p-STAT1表達(dá)減少,其反饋性調(diào)節(jié)作用減弱,SOCS1表達(dá)量相對(duì)減少;但是當(dāng)高劑量治療時(shí),隨著p-STAT1表達(dá)增加,再次激發(fā)SOCS1表達(dá)增加,推測(cè)低劑量As2O3可能通過(guò)干預(yù)p-STAT1/SOCS1信號(hào)通路抑制滑膜組織的增殖。SOCS3是STAT3的負(fù)性調(diào)節(jié)子。本實(shí)驗(yàn)中,模型組p-STAT3的活性增強(qiáng)也反饋性引起了SOCS3表達(dá)增強(qiáng),低劑量As2O3干預(yù)治療后,隨著p-STAT3表達(dá)減少,SOCS3表達(dá)量也相對(duì)減少,但尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此看來(lái),As2O3是否對(duì)p-STAT3/SOCS3信號(hào)通路有顯著抑制作用尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

綜上所述,As2O3是抑制滑膜細(xì)胞增殖的良好藥物,該藥可通過(guò)調(diào)控p-STAT1信號(hào)通路抑制關(guān)節(jié)炎進(jìn)展。但是,As2O3畢竟是一種劇毒物質(zhì),具有治癌和致癌雙向作用。RA發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,有多種細(xì)胞共同參與滑膜組織的增殖過(guò)程,As2O3在低劑量時(shí)具有抑制增殖的作用,高劑量可能具有促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和原漿毒作用[12],因此,治療時(shí)間和劑量的積累對(duì)于產(chǎn)生毒副作用都至關(guān)重要。如何在保證療效的前提下,最大限度的降低毒副作用尚需深入探討。是否可以通過(guò)改變給藥方式,減輕體內(nèi)蓄積產(chǎn)生的毒副作用,亦有待進(jìn)一步研究。

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