王葆春,宮曉光,呂云福

（海南省人民醫(yī)院普外科,海南?？?570311）

我們通過建立阻塞性黃疸（阻黃）大鼠肝纖維化模型,應用水溶性殼聚糖治療,研究其對肝纖維化的影響。

1 材料與方法

1.1 動物和分組 健康雄性SD大鼠72只,體重250-280 g,由本院實驗動物中心提供,隨機分成3組:（1）膽總管不結扎+生理鹽水組（SO組）;（2）膽總管結扎+生理鹽水組（BDL+NS組）;（3）膽總管結扎+水溶性殼聚糖組（BDL+WSC組）。每組術后再隨機分設7、14、21 d個3時相點,每個時相點8只。

1.2 動物模型制作 術后6 h,SO組、BDL+NS組行腹腔內注射NS（2ml/kg體重,1次/d）;BDL+水溶性殼聚糖組腹腔內注射WSC（600 mg/kg體重,1次/d）。分籠普通飼養(yǎng),自由進水進食。

1.3 檢測方法和觀察內容 分別于術后7、14、21 d取材。（1）自動生化分析儀測定血清谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、總膽紅素（TB）。（2）肝組織蘇木素-伊紅（HE）染色。（3）試劑盒檢測HSC內MDA、SOD含量:按試劑盒說明書進行操作測定。（4）用RT-PCR檢測 I、III型膠原。I型膠原PCR引物序列:Sence5-ACAGGCGAACAAGGTGACAGAG-3,Antisence5-GCCAGGAGAACCAGCAGAGC-3（158 bp）;

Ⅲ型膠原PCR引物序列:Sence5-AGATGCTGGTGCTGAGAAGAAAC-3;Antisence5-GCTGGAAAGAAGTC TGAGGAAGG-3（137 bp）

2 結果

2.1 肝功能測定結果 ALT、AST、TB值在膽管梗阻7、14 d時BDL+NS組比BDL+WSC組升高明顯,差異有統(tǒng)計學意義（7 d,P＜0.05;14 d,P＜0.05）,而21 d時兩組均明顯升高,差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 光鏡觀察 膽管結扎7 d,肝細胞出現點狀壞死和少量纖維組織增生;膽管結扎14 d時肝小葉內可見多種形態(tài)的壞死灶,周圍炎性細胞浸潤,纖維組織及小膽管廣泛增生;膽管結扎21 d時肝組織增生更明顯,結構紊亂呈肝硬化特征;BDL+WSC組在7、14 d時肝組織病理改變均較BDL+NS組輕;膽總管結扎+WSC組21 d時兩組改變基本相同。

2.3 HSC內MDA測定結果 膽道梗阻后MDA顯著升高,隨著梗阻的遷延升高更明顯。WSC治療后,7、14 d時MDA顯著降低（7 d,P＜0.01;14 d,P＜0.05）,但21 d時,與BDL+NS組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 各組和各時相段HSC內MDA含量測定結果（±s±s,nmol/mg p rot）組別 n 7 d 14 d 21 d SO組 8 10.87±2.23 10.48±2.53 10.44±2.32 BDL+NS組 8 25.45±4.27 34.63±5.44 41.31±5.76 BDL+WSC組 8 18.54±3.95** 26.39±4.58* 39.68±5.19注:與BDL+NS組比較,**P＜0.01,*P＜0.05

2.4 HSC內SOD測定結果 膽道梗阻后SOD顯著降低,隨著梗阻的遷延降低更明顯。WSC治療后,7、14 d時SOD顯著升高（7 d,P＜0.01;14 d,P＜0.05）,但21 d時,與BDL+NS組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表3-6 各組和各時相段HSC內SOD含量測定結果（±s±s,nmol/mgprot）組別 n 7 d 14 d 21 d SO組 8 58.39±3.13 57.36±3.09 58.37±3.23 BDL+NS組 8 41.68±3.82 35.84±4.43 32.68±4.69 BDL+WSC組 8 47.22±3.49 42.75±5.08* 33.53±4.61注:與BDL+NS組比較,**.P＜0.01,*P＜0.05

2.5 用RT-PCR檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原和 TNF-αmRNA

SO組大鼠纖維化相關調控基因I、III型膠原、TNF-α的表達相對較低或不表達;與SO組比較,BDL+NS組Ⅰ、Ⅲ型膠原、TNF-αmRNA表達水平明顯上升（P＜0.01）,與BDL+NS組比較,BDL+WSC組Ⅰ、Ⅲ型膠原、TNF-α表達水平明顯下降。

3 討論

21 d時大鼠肝臟Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達變化

多糖是構成生命的四大基本物質之一,是重要的生物活性物質。多糖作為一種天然的高分子化合物,與生命的各種生理機能密切相關,產生多種多樣的生物學功能,如免疫調節(jié)、抗感染、抗腫瘤、抗凝血、降血糖和抗病毒等。目前,有關糖類在肝臟疾病中的研究已有不少報道,例如,Lee等[1]研究發(fā)現,肝細胞表面的去唾液酸化糖蛋白受體及其甘露糖N-乙酰葡萄糖受體可以清除體內異常的糖基化蛋白以維持血清糖蛋白的平衡。因此,可通過檢測血清中N-糖基化蛋白譜的異常分布來判斷肝細胞功能受損情況。還有研究[2-4]發(fā)現,肝炎和肝癌患者血清中轉鐵蛋白的糖鏈異常。在多糖保肝、護肝和抗纖維化方面,一些生物活性多糖,如云芝多糖和香菇多糖等的作用已得到公認。

肝纖維化是肝病的共有病理改變,肝星狀細胞（HSC）在肝纖維化形成中膠原的過度合成時起著非常重要的作用,HSC的活化和增殖在纖維形成中起著關鍵作用。HSC的激活及其激活后ECM的異常表達是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的關鍵。HSC在肝纖維化形成時膠原的過度合成中起著主要的作用[5],HSC的活化和增殖在纖維形成中起著關鍵作用,肝星狀細胞活化后可以合成大量細胞外基質。TNF-α的大量釋放可參與肝臟的損傷和修復循環(huán),并最終引起肝臟大量ECM的合成與沉積,因此HSCs是肝臟中TNF-α的主要來源;TNF-α可進一步激活HSC,Weiner等[5,6]研究發(fā)現,TNF-α不僅可使體內外培養(yǎng)的大鼠肝臟Ito細胞增加合成膠原蛋白和蛋白多糖約3.5和2.6倍,增加3T3 L1脂肪細胞系Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型前膠原mRNA的表達,而且還能消除轉化生長因子β對大鼠Ito細胞增殖的抑制作用,促使Ito細胞增殖并分泌纖維連接蛋白和蛋白多糖等基質。Czaja等[7]發(fā)現,肝纖維化早期肝內TNF-αmRNA首先出現并逐漸增高,隨后Ⅰ型膠原mRNA含量開始上升,至肝纖維化晚期,TNF-αmRNA水平逐漸下降,而Ⅰ型膠原mRNA水平持續(xù)升高,表明TNF-α在肝纖維化啟動和發(fā)展過程中起重要作用。許多研究顯示肝纖維化時Ⅰ型和Ⅲ型膠原的表達水平是增加的[8]。通過體內試驗發(fā)現抗氧化劑可以防止氧化應激、脂質過氧化和肝纖維化,提示氧化應激可以直接或者間接對HSC表現出促纖維相關的刺激[9,10]。

本實驗結果顯示,膽總管梗阻不同時期肝纖維化明顯異常,隨病程進展,肝纖維化水平增強隨之加重。而肝纖維化是阻黃導致肝硬化的細胞病理機理之一[11]。用WSC治療后,大鼠HSC內SOD的含量在7、14 d時明顯高于對照組（7 d,P＜0.01;14 d,P＜0.05）,而且使MDA含量降低（7 d,P＜0.01;14 d,P＜0.05）,肝臟功能明顯得到保護。與對照組比較,BDL+NS組 Ⅰ 、Ⅲ型膠原 、TNF-αmRNA 表達增加。與BDL+NS組相比,BDL+WSC組的Ⅰ、Ⅲ型膠原、TNF-αmRNA表達減少。因此說明WSC抑制了脂質過氧化反應,從而減輕阻黃時肝損傷,其機制可能是WSC使氧自由基（如O2-和·OH）與線粒體膜的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質過氧化反應減少,減輕了脂質過氧化物對線粒體膜完整性的破壞;減輕了氧自由基抑制線粒體的氧化磷酸化,使能量生成減少程度下降,從而減輕肝臟的纖維化。

另外,本實驗中還可見用WSC治療至21 d后,BDL+NS組和BDL+WSC組中SOD都更進一步減少,但兩組比較,差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。提示水溶性殼聚糖只在早、中期能夠通過減少自由基的產生,減輕脂質過氧化損傷,,從而起到保護HSC,減輕肝臟損傷的作用,但晚期效果仍差,需要進一步尋找能更有效的保護抗肝纖維化藥物。本研究開展了低聚殼聚糖在抗肝纖維化方面的作用研究,并探討了其作用機制,豐富了中藥多糖的抗肝纖維化作用,為尋找特異、有效的抗肝纖維化治療藥物奠定了基礎。

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