楊 銅,鄧玉婷,田 偉,周穎澤,姚瓊芬,葉燕珊,陳 麗,劉健華

(華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院國家獸藥殘留基準實驗室,廣東廣州 510642)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA),俗稱綠膿桿菌,在自然界廣泛分布,是動物和人常見的條件性致病菌,已成為醫(yī)院獲得性感染最重要的致病菌之一[1]。有研究表明,在美國醫(yī)院獲得性感染中,PA在所有的病原菌中排名第5位,在革蘭陰性菌中排第二[2]。國內細菌耐藥性監(jiān)測結果顯示,該菌是引起醫(yī)院感染的第二位病原菌,其檢出率高達16.4%,僅次于大腸埃希菌[3]。由于存在多種主動外排系統(tǒng),銅綠假單胞菌對多種抗菌藥物表現(xiàn)為天然性或獲得性耐藥,故在其所致感染時可供選擇的有效抗菌藥物甚少。同時,隨著抗菌藥物的廣泛使用,其耐藥率不斷升高,給臨床治療和控制帶來了很大的困難,成為臨床抗感染治療中的一個難點[4-5]。

銅綠假單胞菌是犬、貓膿皮癥和尿道感染的常見病原菌,可引起犬的外耳炎和貓的角膜炎等。目前,國內外已有大量關于人源菌株耐藥性的研究[1,5-6],動物源銅綠假單胞菌耐藥情況僅在國外有少量的報道[1,7]。本試驗擬調查寵物源銅綠假單胞菌對臨床常用抗菌藥物的敏感性,為寵物臨床抗菌藥的合理使用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 2009年7月至2010年3月,從廣州市3家和深圳市1家寵物醫(yī)院采集健康或患病犬貓的直腸拭子、膿汁、鼻液、眼分泌物、耳分泌物等共472個樣品。

1.2 藥品及培養(yǎng)基 鏈霉素、氯霉素、萘啶酸和鹽酸四環(huán)素購自廣州威佳科技有限公司,氨芐西林、慶大霉素、阿米卡星、黏菌素、頭孢曲松納、頭孢他啶、環(huán)丙沙星購自中國藥品生物制品檢定所,氟苯尼考和恩諾沙星購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。阿莫西林/克拉維酸、頭孢哌酮/舒巴坦、亞胺培南、美羅培南及哌拉西林藥敏紙片購自OXOID公司。LB肉湯、LB瓊脂、MH瓊脂、MH肉湯、十六烷三甲基溴化銨瓊脂購自青島海博生物技術有限公司。

1.3 細菌分離鑒定 將樣品接種于LB肉湯試管中,37℃恒溫搖床培養(yǎng)16～18 h。劃線于十六烷三甲基溴化銨瓊脂上,培養(yǎng)18～24 h后,挑取邊緣粗糙不齊、灰色或使瓊脂變成綠色的可疑菌落進行純培養(yǎng),對純培養(yǎng)后的菌進一步采用PCR方法進行鑒定。參考Lavenir等[8]報道的gyrB引物序列,由北京華大生物工程有限公司合成。用水煮法提取細菌DNA,根據(jù)一般的PCR反應程序進行。陽性PCR產物送北京華大生物工程有限公司測序,將測序結果提呈NCBI進行序列比對。

1.4 藥物敏感性檢測 除阿莫西林/克拉維酸、頭孢哌酮/舒巴坦、亞胺培南、美羅培南及哌拉西林采用紙片擴散法檢測藥物敏感性外,其余藥物均采用瓊脂稀釋法,兩種方法按照美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI)推薦的操作程序進行,同時用大腸桿菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC 27853作為質控菌株。參照CLSI的標準判斷耐藥(R)、敏感(S)或中介(I)。

2 結果

2.1 細菌分離、鑒定結果 根據(jù)菌落形態(tài)和gyr B基因測序結果,從臨床采集的472個樣本中共分離鑒定銅綠假單胞菌49株,每只動物僅分離1株菌。

2.2 抗菌藥物敏感性結果 銅綠假單胞菌對18種抗菌藥物的敏感性結果如表1所示。49株菌對β內酰胺類抗生素中的氨芐西林和阿莫西林/克拉維酸均100%耐藥,頭孢曲松、頭孢他啶、哌拉西林和頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率較低,分別為10.2%、10.2%、6.1%和2.0%,對碳青霉烯類抗生素敏感,僅有 1株菌對美羅培南表現(xiàn)出耐藥。對萘啶酸100%耐藥,對環(huán)丙沙星和恩諾沙星的耐藥率分別為20.4%和18.4%。氨基糖苷類抗生素中耐藥率最高的為鏈霉素(55.1%),其次為慶大霉素16.3%,阿米卡星6.1%。在其他幾種抗菌藥物中,氟苯尼考98.0%,其他依次為四環(huán)素 93.9%,氯霉素89.8%和黏菌素26.5%。除阿米卡星、慶大霉素和環(huán)丙沙星外,其余MIC90均大于或等于32μg/m L。

表1 49株寵物源銅綠假單胞菌藥物敏感性結果

49株寵物源銅綠假單胞菌全部對至少4種抗菌藥物耐藥,其中只有1株菌只耐4種抗菌藥物,其余48株菌均對4種以上抗菌藥物耐藥,1株菌同時耐14種藥物。4～5耐菌株為6株(12.2%),6～7耐菌株有 25株(51.0%),8～9耐菌株有 8株(16.3%),9耐以上菌株為10株(20.4%)。其中7耐菌株最多為13株占26.5%。同時對哌拉西林、頭孢他啶、環(huán)丙沙星、慶大霉素和亞胺培南5種治療銅綠假單胞菌感染最主要藥物中的3種或3種以上藥物耐藥的菌株稱為多重耐藥銅綠假單胞菌(multidrug-resistant PA,MDRPA)[5],在研究中共發(fā)現(xiàn)3株,占6.2%。

3 討論

3.1 寵物源銅綠假單胞菌耐藥現(xiàn)狀 銅綠假單胞菌能夠通過自身的外排泵系統(tǒng)和外膜蛋白在能量的支持下選擇性或非選擇性將藥物排出而對多種藥物產生天然耐藥,包括青霉素類、氯霉素類、四環(huán)素類和喹諾酮類等藥物,同時該菌還可通過獲得性耐藥機制對多種臨床常用抗菌藥物產生耐藥,因此給臨床治療帶來嚴重困難[9]。本研究結果顯示,銅綠假單胞菌對氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸和萘啶酸的耐藥率均為100%,對氯霉素、氟苯尼考和四環(huán)素也有極高的耐藥率,均達到了90%左右,而氟喹諾酮類、氨基糖苷類、第三代頭孢菌素、哌拉西林和頭孢哌酮/舒巴坦等耐藥率均較低,該結果和預期基本一致。由此可見,這些藥物在治療臨床銅綠假單胞菌感染還可能會有比較好的效果。對于出現(xiàn)1株耐美羅培南菌株應引起我們的重視,因為美羅培南被認為是人醫(yī)臨床治療銅綠假單胞菌重度感染的最后幾種藥物之一[10],寵物出現(xiàn)耐碳青霉烯類藥物的菌株必將帶來嚴重的公共衛(wèi)生問題。由于所調查寵物醫(yī)院未用過碳青霉烯類藥物,此美羅培南耐藥菌株有可能是由人體通過某些途徑傳播給寵物。另外,本研究中發(fā)現(xiàn)有多重耐藥銅綠假單胞菌,它們的出現(xiàn)會使得治療銅綠假單胞菌感染用藥選擇越來越少。

3.2 與國內人源銅綠假單胞菌耐藥性的比較 銅綠假單胞菌已成為了醫(yī)院獲得性感染的重要條件性致病菌之一,近年來關于人醫(yī)臨床銅綠假單胞菌的耐藥性國內外均做了大量的研究和報道,其總體結果顯示,銅綠假單胞菌的耐藥率呈現(xiàn)上升趨勢。中國2008年CHINET[3]和2006～2007年Mohnarin[11]細菌耐藥監(jiān)測結果表明,人源菌株對臨床上使用的氟喹諾酮類藥物耐藥率為25.2%～39.7%,對阿米卡星的耐藥率為15.5%～21.9%,對頭孢他啶的耐藥率為21.0%～29.9%,對哌拉西林的耐藥率為32.6%～43.1%,對頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率為14.8%～21.3%,對碳青霉烯類藥物的耐藥率為24.5%～33.2%。廣州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院2007年的耐藥監(jiān)測結果顯示,銅綠假單胞菌對以上藥物的耐藥率分別為35.4%、13.1%、33.1%、34.6%、23.5%、30.6%～36.5%[6]。與人源菌株耐藥率相比,本試驗的寵物源菌株的耐藥率要低很多,究其原因可能是由于人源菌株多分離于住院病人,其中相當一部分是從重癥監(jiān)護病房分離所得菌株,在大劑量的抗生素使用壓力下產生了較高的耐藥性。

3.3 與國外寵物源銅綠假單胞菌耐藥性比較 由于銅綠假單胞菌引起寵物的感染越來越多,加之其耐藥機制復雜且極易對抗菌藥物產生交叉耐藥和多重耐藥,給臨床治療帶來較大困難,因此部分國外學者已對寵物源該菌的耐藥性做了相關報道。Rubin等[1]的研究顯示,寵物源銅綠假單胞菌對氨芐西林、氯霉素、四環(huán)素、奈啶酸以及阿莫西林/克拉維酸的耐藥率均超過90%,敏感性較好的是慶大霉素、阿米卡星、頭孢他啶、亞胺培南和美羅培南,耐藥率均在10%以下,環(huán)丙沙星的耐藥率為16%,與本試驗結果基本一致。但恩諾沙星和頭孢曲松的耐藥率均在30%以上,明顯高于本試驗的18.4%和10.2%,究其原因可能是國內外寵物臨床治療藥物的選擇不同所造成的。另外,Rubin等[1]的研究同樣發(fā)現(xiàn)碳青霉烯類藥物耐藥菌株。

本試驗首次報道了國內部分地區(qū)寵物源銅綠假單胞菌的耐藥狀況,發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌耐藥狀況比較嚴重,但對頭孢他啶、阿米卡星、慶大霉素和氟喹諾酮類抗菌藥的敏感性較高。結果提示有必要開展寵物源細菌耐藥性監(jiān)測,對銅綠假單胞菌的耐藥性進行更為深入的研究對制定特異性的治療方案具有極其重要的作用。

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