吳培福,曲偉杰,郭愛(ài)偉

(1.西南林業(yè)大學(xué)保護(hù)生物學(xué)學(xué)院,云南昆明 650224;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650201)

氟是動(dòng)物生長(zhǎng)所必需的元素,適量的氟有利于機(jī)體預(yù)防齲齒、維持鈣磷代謝和保持神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo),但攝入過(guò)量的氟可導(dǎo)致機(jī)體中毒,引起人和動(dòng)物機(jī)體多系統(tǒng)功能損害,主要表現(xiàn)為氟骨癥和氟斑牙,并對(duì)人和動(dòng)物的健康及經(jīng)濟(jì)帶來(lái)了巨大的損害。長(zhǎng)期以來(lái),氟中毒的研究主要集中于氟對(duì)骨骼、牙齒等骨相組織的損傷,而對(duì)非骨相組織的研究很少見(jiàn)到。近年來(lái),隨著氟化物在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用和對(duì)氟中毒病的研究,氟對(duì)非骨相組織的毒性作用逐漸被人們重視[1]。本試驗(yàn)采用石蠟組織切片技術(shù)、細(xì)胞計(jì)數(shù)等方法,系統(tǒng)地探討了氟對(duì)雄性小鼠生殖毒性的作用,為氟致非骨相組織損害的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)所用昆明系小鼠和鼠糧均購(gòu)自昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;制作切片所用的甲醛溶液(分析純)、丙酮(分析純)、酒精、二甲苯(分析純)、軟蠟和硬蠟均來(lái)自本院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠氟中毒模型的建立 選用20只雄性昆明系小鼠,隨機(jī)分為4組,分別飼喂含0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L和150mg/L氟化鈉的飲水120 d(用蒸餾水配制)。鼠糧購(gòu)自昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。根據(jù)小鼠牙齒損傷的程度來(lái)判斷氟中毒情況。飼喂結(jié)束后,處死小鼠并觀察內(nèi)臟器官的組織病變。1.2.2 睪丸組織切片的制作 參考常規(guī)石蠟組織切片流程進(jìn)行組織切片,即取材、固定、洗滌和脫水、透明 、浸蠟 、包埋 、切片與粘片 、脫蠟 、H.E.染色 、透明和封片觀察。

1.2.3 小鼠精子計(jì)數(shù)和染色觀察 在試驗(yàn)的第120天,拉頸處死實(shí)驗(yàn)小鼠,用眼科剪解剖陰囊,取出小鼠睪丸,摘取附睪,在燒杯中剪碎,用100 m L PBS沖洗,然后取上清在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上進(jìn)行常規(guī)計(jì)數(shù)。此外,將新鮮采集的精子立即涂片,空氣干燥,然后進(jìn)行H.E.染色,顯微鏡觀察,隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)精子,觀察畸形的精子,并計(jì)算畸形精子的比率。

1.2.4 氟中毒致小鼠睪丸細(xì)胞凋亡的觀察 用吖叮橙染液對(duì)睪丸組織細(xì)胞進(jìn)行染色,水洗,而后在熒光顯微鏡下觀察凋亡情況。

1.2.5 氟對(duì)小鼠睪丸細(xì)胞染色體損傷的研究 同上摘取小鼠睪丸,將其剪碎,加入0.9%生理鹽水5 m L,再加入蒸餾水5 m L,用膠頭滴管吹打均勻,靜置20 m in,取上清液與冰乙酸和無(wú)水乙醇(1∶3)的混合液等量混合,取混合液滴在潔凈的載玻片上,將載玻片在酒精燈上過(guò)火1～2次,用姬姆薩染色30 min,水洗,鏡檢。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠氟中毒模型的建立 經(jīng)過(guò)120 d的飼喂,染氟組小鼠出現(xiàn)不同程度的精神委靡、活動(dòng)減少等中毒情況,牙齒出現(xiàn)明顯的氟斑牙癥狀,表現(xiàn)為大部分牙釉質(zhì)脫落,牙本質(zhì)明顯,牙齒表面粗燥、無(wú)光澤、透明度差,牙體散在白色斑點(diǎn)或小斑塊,且凹凸不平,有缺損。其中150 mg/L染氟組牙齒的病變最為明顯。氟對(duì)牙齒的損害存在劑量效應(yīng)關(guān)系,隨染氟量的增加,牙齒的損傷程度越明顯。對(duì)照組小鼠牙齒呈正常表現(xiàn),牙釉質(zhì)呈棕黃色半透明,牙表面光滑而富有光澤。此外,染氟組小鼠還表現(xiàn)為:胃黏膜和肝臟周緣有出血點(diǎn),部分小鼠的腎臟腫大。由以上病變情況可以看出,本試驗(yàn)成功建立了小鼠氟中毒的模型。

2.2 氟對(duì)小鼠睪丸指數(shù)的影響 本試驗(yàn)測(cè)定表明,投氟組睪丸指數(shù)低于對(duì)照組,但氟中毒對(duì)睪丸指數(shù)沒(méi)有明顯的影響。

2.3 氟對(duì)小鼠睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 在顯微鏡下,染氟組小鼠的曲細(xì)精管出現(xiàn)管壁斷裂,結(jié)構(gòu)排列紊亂,生精細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞從生精上皮脫落,部分細(xì)胞的胞膜破裂。次級(jí)精母細(xì)胞、精母細(xì)胞和生精上皮細(xì)胞的核發(fā)生固縮,出現(xiàn)凋亡。曲細(xì)精管中精子的數(shù)量明顯沒(méi)有對(duì)照組多,且精子相互粘連,交連在一起。氟中毒組發(fā)育中的精子細(xì)胞出現(xiàn)畸形,形態(tài)多樣,且部分精子細(xì)胞膜出現(xiàn)破裂?；尉泳唧w表現(xiàn)為蜷曲、斷裂、鉤尾等病變。此外,染氟組大量次級(jí)精母細(xì)胞胞質(zhì)和胞核中出現(xiàn)空泡樣病變,且有微核出現(xiàn)(見(jiàn)圖 1～3)。

睪丸組織結(jié)構(gòu)的病變程度隨著染氟劑量的增加而加重,其中150 mg/L染氟組睪丸的病變最為明顯。另外,隨染氟量的增加,微核率也相應(yīng)地增加。

2.4 小鼠精子計(jì)數(shù)和染色觀察 通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù),發(fā)現(xiàn)氟對(duì)小鼠精子有一定的損傷作用,由表1可以看出,隨著氟中毒劑量的增加,精子數(shù)量明顯下降。對(duì)照組與氟中毒組有顯著的差異(P＜0.05)。

圖3 150 mg/L氟中毒組脫落細(xì)胞的微核率增加(100×)

表1 氟對(duì)小鼠精子數(shù)量的影響

在顯微鏡下,對(duì)照組精子形態(tài)結(jié)構(gòu)完整,而氟中毒組中精子出現(xiàn)蜷曲、鉤尾、雙頭、小頭、斷裂、頂體脫落、粘連等畸形(圖 4、圖5)。

2.5 氟中毒致小鼠睪丸細(xì)胞凋亡的觀察 在熒光顯微鏡下,對(duì)照組細(xì)胞正常,而中毒組出現(xiàn)凋亡樣細(xì)胞,細(xì)胞固縮,有明亮的熒光點(diǎn),其中100 mg/L中毒組最為明顯。150 mg/L氟中毒組中細(xì)胞的凋亡量小于100 mg/L中毒組,但出現(xiàn)了大量的死亡細(xì)胞,表現(xiàn)為胞核熒光散大。

2.6 氟對(duì)小鼠睪丸細(xì)胞染色體損傷的研究 對(duì)照組細(xì)胞的染色體沒(méi)有任何異?，F(xiàn)象,氟中毒組細(xì)胞的染色體出現(xiàn)環(huán)形、交換異常等現(xiàn)象。

3 討論

3.1 氟中毒模型的建立 氟中毒一般呈地方流行性,且飲水型氟中毒常呈慢性中毒。本試驗(yàn)采用給動(dòng)物投服高氟水的途徑給氟,簡(jiǎn)單易行,符合飲水型氟中毒的攝氟途徑。通過(guò)試驗(yàn)分析結(jié)果可以看出,給小鼠飼喂高濃度的含氟水3個(gè)月,便可引起明顯的氟中毒,這與以往的報(bào)道相一致。氟中毒模型建立所需時(shí)間的長(zhǎng)短與投氟的途徑、氟化物的濃度、采用的試驗(yàn)動(dòng)物等有關(guān)。如高劑量的氟引起中毒的時(shí)間短,不同的動(dòng)物對(duì)氟的耐受性不一樣。

3.2 氟對(duì)小鼠睪丸指數(shù)的影響 本試驗(yàn)顯示氟中毒對(duì)器官發(fā)育上的影響不大,這與以往的研究結(jié)果相一致,但王建[2]對(duì)雞的研究結(jié)果表明,染氟雞體質(zhì)量、睪丸質(zhì)量、睪丸質(zhì)量/體質(zhì)量均顯著低于對(duì)照組,與本試驗(yàn)不一致。這可能與以下原因有關(guān):染氟劑量不一樣;不同的劑量對(duì)組織器官的損傷程度不一樣;投氟時(shí)間長(zhǎng)短不一樣;動(dòng)物品種不一樣;不同動(dòng)物品種對(duì)氟的耐受量不一樣。

3.3 氟對(duì)小鼠睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 睪丸組織主要由生殖細(xì)胞、支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞組成。睪丸的結(jié)構(gòu)與功能是否正常將會(huì)影響精子的質(zhì)和量。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,染氟組睪丸曲細(xì)精管結(jié)構(gòu)排列紊亂,生精細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞發(fā)生脫落,精母細(xì)胞胞質(zhì)和胞核中出現(xiàn)大量的空泡樣病變,細(xì)胞的微核率增加,精子出現(xiàn)畸形。Kour研究表明,氟可使小鼠曲精小管退化壞死,精子發(fā)育停止[9]。寧可欽和甄炯[3-4]等研究發(fā)現(xiàn),高氟對(duì)睪丸組織支持細(xì)胞、精子細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞損傷明顯。崔留欣等[5]研究表明,氟致各級(jí)生精細(xì)胞損傷中,以精子細(xì)胞為主。該研究結(jié)果的差異,可能與染氟劑量、投氟時(shí)間長(zhǎng)短、動(dòng)物品種等有關(guān)。

精子的形成與睪丸組織結(jié)構(gòu)的完整性有直接的關(guān)系。氟中毒時(shí),睪丸的組織結(jié)構(gòu)受到不同程度的損傷,這不難解釋染氟組精子數(shù)量少的原因。此外,氟是一種很活潑的元素,對(duì)精原細(xì)胞、精子等可能有直接的作用,因而,出現(xiàn)各種畸形和相互的粘連。

3.4 小鼠精子計(jì)數(shù)和染色觀察 精子數(shù)量、形態(tài)和活動(dòng)率是分析雄性生殖功能的重要指標(biāo)之一。唐前華等[6]研究表明,隨著尿氟逐漸升高,精子數(shù)量、精子活動(dòng)率均較明顯遞減,精子活動(dòng)力也明顯減弱。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示染氟后,氟組大鼠精子計(jì)數(shù)、精子活動(dòng)率均顯著低于對(duì)照組,精子畸形率顯著高于對(duì)照組,與以往的試驗(yàn)結(jié)果相一致。

3.5 氟中毒致小鼠睪丸細(xì)胞凋亡的觀察 有關(guān)氟致小鼠睪丸細(xì)胞凋亡的報(bào)道很少,本試驗(yàn)表明,氟可引發(fā)睪丸細(xì)胞的凋亡,且100mg/L時(shí)最為明顯。氟引發(fā)睪丸細(xì)胞凋亡的機(jī)理可能與以下因素有關(guān):誘導(dǎo)自由基產(chǎn)生而導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化作用增強(qiáng);與生殖系統(tǒng)中組織器官細(xì)胞膜受損離子通道改變有關(guān);作為酶抑制劑抑制相關(guān)酶活性,尤其是二價(jià)金屬離子為輔基的酶。

3.6 氟對(duì)小鼠睪丸細(xì)胞染色體損傷的研究 有關(guān)氟的遺傳毒性方面,目前仍有爭(zhēng)議[7-8]。梁玉華等研究表明,高氟可引起染色體斷裂,導(dǎo)致染色體畸變。Tsutsui曾觀察到氟化物可引起培養(yǎng)的敘利亞地鼠胚胎細(xì)胞新生物的形態(tài)轉(zhuǎn)化,胚胎細(xì)胞的染色體畸變率、姐妹染色單體互換率及程序DNA合成明顯增加[8]。這些研究結(jié)果與本試驗(yàn)一致。氟化物到底是否具有遺傳毒性,還需進(jìn)一步的研究。

[1] 徐海峰,牛廣明,陳克,等.過(guò)量攝入氟化物對(duì)多器官損傷的研究[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志,2009,41(4):385-388.

[2] 黎曉敏,秦港,王建.實(shí)驗(yàn)性氟中毒雞睪丸組織的病理學(xué)研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2006,37(7):717-721.

[3] 寧可欽,袁淑德,劉偉,等.慢性氟中毒大鼠睪丸和前列腺的超微結(jié)構(gòu)觀察[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1990,19(5):3393-3420.

[4] 甄炯,陳榮安,章孟本,等.氟化鈉對(duì)雄性大鼠生殖系統(tǒng)影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病,1993,19(4):202-207.

[5] 崔留欣,姜春霞,王錫林,等.氟致雄性大鼠生殖功能損害的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)地方病學(xué)雜志,2003,22(3):195-197.

[6] 唐前華,孫發(fā).燃煤型氟中毒對(duì)人體精子活力的影響[J].醫(yī)藥與保健,2009,17(8):84-85.

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[8] 周健.氟的生殖、遺傳毒性和對(duì)子代健康影響的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2008,35(14):2640-2643.