張成圖,陳永忠,韓 樂,李啟成,王淑琴

(青海省西寧市畜牧獸醫(yī)站,青海西寧 810003)

豬瘟(CFS)是由黃病毒科瘟病毒屬的豬瘟病毒(CFSV)引起的豬的一種高度接觸性傳染病。各個年齡段的豬群,不分品種對其均易感,病死率高,傳播迅速,目前依然是危害我國養(yǎng)豬業(yè)主要傳染病之一。根據(jù)世界動物衛(wèi)生組織(OIE)制定的《陸生動物衛(wèi)生法典》2005版,豬瘟被列為必須報告的傳染病之一,近年來豬瘟的流行形式和發(fā)病特點都有所變化,主要表現(xiàn)為隱性感染、亞臨床感染或非典型性,使得豬瘟成為現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)的重大隱患,單憑臨床診斷十分困難,必須以實驗室檢驗技術(shù)。為了有效地控制豬瘟的發(fā)生,我們于2008年對西寧市郊生豬規(guī)模養(yǎng)殖場和調(diào)進生豬豬瘟流行情況,應(yīng)用ELISA法進行了調(diào)查,調(diào)查結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 血液樣品的采集 來自西寧市郊3個規(guī)模養(yǎng)殖場,分為5批調(diào)進生豬。

1.2 主要試劑 CFSV抗原、ELISA診斷試劑盒,美國IDEXX公司生產(chǎn),批號為43220-RO11。

1.3 酶標(biāo)儀 Labsystem Dragon Wellscan MK-3型。

1.4 操作方法 (1)加10倍的25μL樣品稀釋液和475μL被檢血液到微量管中進行渦旋混合。(2)在室溫下感作1 h,也可在溫箱中渦旋相同時間,感作后可直接用于試驗,即75μL血液到檢測孔中,再加5×10μL樣品稀釋液(10×),稀釋時用相等體積的蒸餾水,混合時用全盤/條震蕩后按步驟進行。(3)步驟:每板每孔中用移液槍嘴加入稀釋液 25 μL,加全血25μL;加豬瘟酶標(biāo)二抗25μL;加診斷液25μL,振蕩3 min后,室溫孵化 1 h。

1.5 判定標(biāo)準(zhǔn)

1.5.1 計算樣品和對照孔的吸收值(OD490)計算相對應(yīng)的樣品和對照的OD490值,樣品合乎陽性對照的平均吸收值首先要成立,正確的OD490值應(yīng)當(dāng)是樣品或陽性對照的OD490值減陰性對照的OD490值,正確OD490值=樣品OD490值-陰性對照OD490值。

1.5.2 為了使試驗數(shù)據(jù)真實可靠,陽性對照的OD490值必須大于0.50;陰性對照的OD490值應(yīng)比陰性對照OD490值的20%還低,假如得不到該值,請檢查所使用的儀器設(shè)備和操作步驟,檢查后陰性對照的OD490值仍然很高的話,請求將樣品重新10 000 r/min離心3～5 min,并重新檢測。

2 結(jié)果判定

OD490值等于或大于0.30為陽性,OD490值等于或小于0.20為陰性,OD490值介于0.2～0.3之間為可疑。

2.1 調(diào)進生豬血清學(xué)檢測結(jié)果 128份被檢血清,檢出陽性血清15份,陽性率為11.72%。其中一批檢出陽性2份,陽性率為8.00%;二批檢出陽性2份,陽性率為8.33%;三批檢出陽性4份,陽性率為17.39%;四批檢出陽性 1份,陽性率為 3.84%;五批檢出陽性5份,陽性率為16.67%。結(jié)果見表1。

表1 調(diào)進生豬豬瘟檢測結(jié)果

2.2 規(guī)模養(yǎng)殖場生豬血清學(xué)檢測結(jié)果 108份被檢血清,檢出陽性血清8份,陽性率7.40%,其中一場檢出陽性2份,陽性率為5.88%;二場檢出陽性3份,陽性率為11.11%;三場檢出陽性3份,陽性率為6.38%。本次檢測結(jié)果為108份被檢樣品,陽性8份,陽性率7.40%。結(jié)果見表2。

表2 自繁自育豬瘟檢測結(jié)果

3 討論與小結(jié)

夾心ELISA是檢測病毒抗原的常用方法,許多文獻已報告了夾心ELISA方法的研究應(yīng)用。Kosmidou等(1995)使用單克隆抗體技術(shù)建立了一種豬瘟病毒抗原的ELISA方法[1],在夾心ELISA方法的建立中,制備高效價、高生物活性的包被抗體和酶標(biāo)抗體是本試驗成功的關(guān)鍵所在。本試劑盒對全血、外周血液或細胞培養(yǎng)物敏感,夾心ELISA試劑具有較高的特異性和敏感性,可用于豬瘟的診斷[2],對檢出的陽性病豬及時淘汰,從而有利于豬瘟的控制與凈化。

目前,生豬規(guī)模養(yǎng)殖場非典型豬瘟的發(fā)病數(shù)有所上升,并已成為養(yǎng)殖場常見傳染病之一,近幾年我們通過針對性調(diào)查,證實目前豬瘟的流行病學(xué)臨床癥狀、剖檢病變等方面都發(fā)生了變化,臨床檢查很難判定原因,因而易被誤診而拖延最佳防治時機,必須結(jié)合實驗室檢驗方法最終確診。應(yīng)用本方法可有助于對豬瘟的流行病學(xué)調(diào)查和診斷,從而快速撲滅疫點,控制疫情[3]。

從結(jié)果看,有23例陽性,已注射過豬瘟疫苗的豬仍呈陽性,筆者初步認(rèn)為有兩個可能原因:一是由于這幾年規(guī)模化種豬場豬繁殖和呼吸道綜合征及偽狂犬病等影響和破壞豬體免疫系統(tǒng)的新發(fā)傳染病的出現(xiàn),干擾了豬瘟抗體的產(chǎn)生和維持,導(dǎo)致疫苗免疫后仍出現(xiàn)豬瘟病豬;二是豬瘟疫苗毒株和流行毒株可能存在差異,進而導(dǎo)致免疫失敗,鑒于此,我們必須一方面對豬瘟予以高度重視,增加對可疑樣品的及時診斷和豬瘟疫情的動態(tài)監(jiān)測,以保護養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。

從調(diào)查結(jié)果來看,外省調(diào)進的生豬豬瘟陽性高于本地自繁自育豬場,因此我們應(yīng)該加大對進入我市的生豬加強監(jiān)管力度,仔豬調(diào)運嚴(yán)格實行報檢制度,販運仔豬到達后一律隔離觀察,確認(rèn)健康后方可進入流通環(huán)節(jié),對防制和凈化本病有重要作用。

目前疫苗注射仍然是防治本病的最重要的手段之一,因此,在生豬飼養(yǎng)的各個環(huán)節(jié)注重疫苗免疫注射,注意注射方法和注射劑量,確保免疫抗體達到保護水平,對控制和凈化豬瘟具有決定性的意義。

[1] Kosmidou R,Ahi.H-J-Th,E weiland.Differentiation of classical swine fever virus(CSFV)strains using monoclonal antibodies against structu ral globulinproteins[J].Veterinary Microbiology,1995(4):111-118.

[2] 鄭長生,萬春云,王姣.ELISA和PT-PCR技術(shù)診斷豬瘟的研究進展[J].養(yǎng)殖與飼料,2009(3):48-51.

[3] 湯賽冬,周雪芳,周光勝,等.檢測豬瘟抗原的夾心ELISA診斷試劑盒的制備標(biāo)化和應(yīng)用的研究[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊,2002,2:14-15.