楊克平 張?jiān)品?李 欣

擴(kuò)張型心肌病患者Th17/Treg的變化及意義

楊克平 張?jiān)品?李 欣

本文2010-08-09收到,2010-10-08修回,2010-10-25接受

擴(kuò)張型心肌病(Dilated Cardiomyopath,DCM)是一類病因不明、表現(xiàn)為左心或雙心室異常擴(kuò)大、心肌收縮功能障礙的心臟疾患。病毒感染及自身免疫反應(yīng)可能是其主要原因;炎癥在DCM發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。過去研究表明Th1/Th2細(xì)胞失衡在急性病毒性心肌炎(Acute V iralM yocarditis,AVMC)病程中起重要作用。近來的研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞及CD4+CD25+T reg細(xì)胞是一種不同于Th1和 Th2的新型CD4+T細(xì)胞亞類,二者比例失衡在動(dòng)脈粥樣硬化性疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等慢性炎癥性疾病和自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重大的作用[1,2]。本文通過對(duì)AVMC患者和DCM患者外周血中Th17和CD4+CD25+Treg細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子的檢測分析,探討Th17/Treg的變化及其與DCM發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 對(duì)象

選擇我院2009年3月～2010年5月住院患者共28例,包括 AVMC 患者 12例,男 7例,女 5例,平均年齡26±8歲;DCM 患者16例,男11例,女5例,年齡42±9歲,既往均有心肌炎病史。診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)我國1999年全國心肌炎心肌病會(huì)議確定的關(guān)于成人急性病毒性心肌炎診斷參考標(biāo)準(zhǔn)和采納世界衛(wèi)生組織及國際心臟病學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)工作組關(guān)于心肌病定義和分類的意見及2007年頒布的心肌病診斷和治療建議[3]。另選取我院門診健康體檢者12例對(duì)照,其中男8例,女4例,年齡40±12歲。所有對(duì)象均排除并發(fā)有肝功能和(或)腎功能不良患者,急、慢性感染,風(fēng)濕性疾病3個(gè)月內(nèi)有風(fēng)濕活動(dòng),自身免疫性疾病患者,腫瘤患者及妊娠者,近期均未使用激素及免疫抑制劑,排除對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

1.2 檢測方法

1.2.1 標(biāo)本的采集與處理:采清晨靜脈血6 m l,肝素抗凝;一部分離心后取血清凍存于-70℃以檢測白介素-17(IL-17)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1),另一部分應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液以Ficoll密度梯度法分離出外周血淋巴細(xì)胞,經(jīng)含1%小牛血清的PBS洗滌后,制備淋巴細(xì)胞懸液,濃度1×109/L,用于流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17和T reg細(xì)胞。AVMC患者被采血時(shí),心肌酶肌酸激酶同功酶及肌鈣蛋白均高于正常值,表明處于急性炎癥期。

1.2.2 血清IL-17、TGF-β1水平檢測:取上述凍存血清,采用ELISA法檢測血清中IL-17、TGF-β1水平,具體操作按試劑盒(美國Biosource公司)提供的說明書進(jìn)行,每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)3個(gè)復(fù)孔,酶標(biāo)測試儀(MB-IV型,北京英達(dá))450nm處讀數(shù)。

1.2.3 外周血Th17細(xì)胞和CD4+CD25+T reg細(xì)胞亞群檢測:取上述淋巴細(xì)胞懸液置于48孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔 1m l,并加佛波酯(50μg/L)、離子霉素(1m g/L)和莫能菌素(2μmol/L)(美國e Bioscience公司),在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng) 5h。收集細(xì)胞分為對(duì)照管和實(shí)驗(yàn)管,加入PE-Cy5標(biāo)記的鼠抗人CD4單抗20μl(美國e Bioscience公司),混勻,室溫避光放置20min對(duì)細(xì)胞表面抗原進(jìn)行染色。加Cy tofix/Cy toperm液200μl,4℃放置20min,通透和固定細(xì)胞,洗滌。實(shí)驗(yàn)管加入FITC標(biāo)記的鼠抗人CD25抗體和FITC標(biāo)記的IL-17抗體(美國e Bioscience公司)各10μl,對(duì)照管加入同型對(duì)照抗體,4℃避光孵育30min后,用Perm/Wash液1m l洗滌2次,最后以300μl洗滌液重懸細(xì)胞,24h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀(FACSA ria,美國Becton Dickinson公司)檢測分析。以CD4直方圖設(shè)門區(qū)分 Th細(xì)胞(CD4+),最終以散點(diǎn)圖IL-17、CD25染色陽性表示Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞,用Cellsquest軟件獲取并分析數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組外周血Th17與T reg細(xì)胞數(shù)量比較

AVMC組與DCM組Th17/Treg無顯著差異,但均高于對(duì)照組(P＜0.05);AVMC組Th17高于DCM組和對(duì)照組(P＜0.05);DCM組 Treg低于AVMC組和對(duì)照組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組患者外周血Th17、Treg細(xì)胞數(shù)量的比較(±s)

表1 各組患者外周血Th17、Treg細(xì)胞數(shù)量的比較(±s)

注:與對(duì)照組比較,1)P＜0.05;與AVMC組比較,2)P＜0.05

組 別 n Th17(%) Treg(%) Th17/T reg對(duì)照組 12 8.26±1.40 5.42±1.20 1.71±0.16 AVMC組 12 15.48±2.601) 4.83±1.10 3.88±0.941)DCM 組 16 9.12±1.502)2.38±0.601)2) 4.16±1.211)

2.2 各組炎癥因子檢測

AVMC組IL-17高于DCM組和對(duì)照組(P＜0.05);DCM 組TGF-β1低于AVMC組和對(duì)照組(P＜0.05)。見表2。

表2 各組患者外周血細(xì)胞因子的比較(±s)

表2 各組患者外周血細(xì)胞因子的比較(±s)

注:與對(duì)照組比較,1)P＜0.05;與AVMC組比較,2)P＜0.05

組 別 n IL-17(pg/m l) TGF-β1(pg/m l)對(duì)照組 12 248.60±118.80 231.70±105.20 AVMC組 12 410.40±127.201) 244.60±114.30 DCM 組 16 283.70±129.602) 145.30±87.401)2)

3 討 論

DCM是一類病因不明、表現(xiàn)為左心或雙心室異常擴(kuò)大、心肌收縮功能障礙的心臟疾患。其病理改變是心肌細(xì)胞凋亡壞死和心肌纖維化引起的心室異常重構(gòu)[4]。DCM發(fā)病機(jī)制不太明確,目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為DCM主要是慢性心肌炎的結(jié)局。臨床對(duì)AVMC患者進(jìn)行長期隨訪,發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)變?yōu)镈CM的概率顯著高于一般人群,提示DCM 與AVMC可能是同一疾病的不同發(fā)病階段[5]。炎癥在DCM發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。將DCM患者外周血淋巴細(xì)胞回輸至重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠可以誘導(dǎo)與擴(kuò)心病類似的嚴(yán)重的心臟病理改變,說明在DCM的發(fā)生過程中免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)起著關(guān)鍵的作用[6]。

過去研究認(rèn)為,Th1/Th2細(xì)胞失衡在病毒性心肌炎病程中起重要作用,近來研究發(fā)現(xiàn) Th17與T reg是兩種不同于Th1及 Th2的新型免疫細(xì)胞,Th17作為效應(yīng)性T細(xì)胞,能產(chǎn)生IL-17而介導(dǎo)炎性反應(yīng)、自身免疫性疾病、腫瘤和移植排斥等的發(fā)生和發(fā)展[7]。Chang等新近研究顯示,在自身免疫性心肌炎小鼠的心肌病灶中,IL-17高水平表達(dá);抗IL-17抗體可以明顯減輕自身免疫性心肌炎病變[8],這提示Th17細(xì)胞在病毒性心肌炎的炎癥機(jī)制中起重要作用。CD4+CD25+T reg是一種具有免疫抑制作用的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,主要通過細(xì)胞接觸機(jī)制或抑制性細(xì)胞因子TGF-β1發(fā)揮主動(dòng)免疫抑制作用,是維持機(jī)體免疫耐受的重要調(diào)控者,它對(duì)機(jī)體中自身反應(yīng)性T細(xì)胞和部分效應(yīng)性 T細(xì)胞的選擇性抑制能避免免疫性疾病的發(fā)生[9]。Th17/Treg失衡的發(fā)生可能觸發(fā)或加劇某些自身免疫性疾病的發(fā)生,但其是否在AVMC的炎癥反應(yīng)及其向DCM轉(zhuǎn)化的過程中發(fā)揮作用尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究顯示AVMC組及DCM組患者外周血Th17/Treg明顯較對(duì)照組高,提示免疫平衡被打破,促進(jìn)了AVMC的發(fā)病及其向DCM的發(fā)展。在AVMC患者外周血中,Th17及IL-17均高于DCM組及對(duì)照組,說明在病毒性心肌炎發(fā)病早期,Th17及其分泌的IL-17介導(dǎo)了心肌急性炎癥反應(yīng),造成了心肌細(xì)胞損傷;而在DCM患者外周血中,Th17及 IL-17較正常人無明顯變化,而T reg及其分泌的TGF-β1均低于AVMC組和對(duì)照組,說明因具有抑制性作用的T細(xì)胞減少引起的慢性炎癥促進(jìn)了心肌細(xì)胞的凋亡壞死和心肌纖維化的形成。

本研究結(jié)果顯示AVMC及DCM的炎癥反應(yīng)形式及參與的炎癥細(xì)胞及因子均有所不同。Th17/T reg的升高可能促進(jìn)了AVMC的炎癥反應(yīng)及其向DCM的轉(zhuǎn)化。盡管Th17/Treg均表現(xiàn)升高,但在AVMC患者中是因分子 Th17升高而升高,而在DCM患者中是因分母變小而升高。這種炎癥反應(yīng)形式的改變機(jī)制尚不清楚,切斷這種機(jī)制也許能阻止AVMC向DCM的轉(zhuǎn)變,積極改善AVMC患者的遠(yuǎn)期預(yù)后。

本文第一作者簡介:

楊克平(1977～),男,漢族,主治醫(yī)師,碩士,從事心臟病炎癥機(jī)制研究

1 Cheng X,Yu X,Ding YJ,et al.The Th17/T reg imbalance in patients with acute coronary syndrome.C lin Immunol,2008,127(1):89～97.

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擴(kuò)張型心肌病患者Th17/Treg的變化及意義

楊克平,張?jiān)品?李 欣/華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬荊州中心醫(yī)院心內(nèi)科,荊州434020

目的:探討 Th17/Treg的變化及其與擴(kuò)張型心肌病(DCM)發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。方法:收集急性病毒性心肌炎(AVMC)患者及DCM患者和健康體檢者的外周血,EL ISA法檢測血清中IL-17及 TGF-β1濃度;經(jīng)PE-CD4、FITCCD25及FITC-IL-17單抗染色后,雙色流式細(xì)胞術(shù)檢測 Th17細(xì)胞及 T reg細(xì)胞的比例。結(jié)果:AVMC組Th17和 IL-17高于DCM組和對(duì)照組;DCM組T reg和TGF-β1低于AVMC組與對(duì)照組;AVMC組與DCM組 Th17/T reg無顯著差異,但均高于對(duì)照組。結(jié)論:Th l7/T reg的升高打破了免疫平衡,促進(jìn)了AVMC的發(fā)病及其向DCM的發(fā)展。

The Change of Th17/Treg in Patients with Dilated Cardiomyopathy and Its Significance

Yang Keping,Zhang Yunfeng,Li Xin/Department of Cardiology,Jingzhou Central Hospital,A ffiliated to Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology,Jingzhou 434020

Dilated cardiomyopathy;Acute viral myocarditis;Th17 cells;Treg cell

R542.2

A

1005-1740(2011)01-0032-03

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬荊州中心醫(yī)院心內(nèi)科,郵政編碼 荊州434020

book=34,ebook=211

Objective:To investigate the change of Th l7/T reg in peripheral blood and its relation with pathogenesis of dilated cardiomyopathy(DCM).M ethod:Blood w as collected from patien ts with acu te viral myo-carditis(AVMC)or DCM and healthy people.Th l7 and Treg subsets in peripheral blood w ere detected by bicolo r flow cytometry after stained with PE-CD4,FITC-CD 25 and FITC-IL-17 mAb.ELISA method wasused formeasuring the levelsof related cy tokines IL-17 and TGF-β1.Results:Both Th17 cell and the level of related cytokine IL-17 in AVM C group were higher than DCM and healthy group.The proportion of Treg cell and the levelof TGF-β1 in DCM group w ere low er than AVMC and healthy group.Th17/Treg between AVMC group and DCM group had no significant differencebut w ere higher than healthy group.Conclusion:The rise of Th17/Treg disrupted the balance of immunity and contributed to the onset of AVMC and the developm en t of DCM.

擴(kuò)張型心肌病 急性病毒性心肌炎 Th17細(xì)胞 T reg細(xì)胞