趙可新 李軍霞 姜杉 王偉剛 胡建平 單靖珊

吉西他濱和絲裂霉素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的作用

趙可新 李軍霞 姜杉 王偉剛 胡建平 單靖珊

目的觀察吉西他濱和絲裂霉素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的抑制效應(yīng)，并探討其作用機(jī)制。方法 用MTT法檢測(cè)化療藥物對(duì)人肺癌細(xì)胞A549生長(zhǎng)的抑制作用;流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞周期分布和凋亡率。結(jié)果 (1)絲裂霉素和吉西他濱單獨(dú)和聯(lián)合用藥可濃度依賴性抑制A549細(xì)胞的生長(zhǎng)。(2)絲裂霉素和吉西他濱在合用72 h后，當(dāng)Fa＞0.18時(shí)，絲裂霉素和吉西他濱合用指數(shù)CI均＜1，兩種藥物之間是協(xié)同作用，當(dāng)Fa＜0.18時(shí)，合用指數(shù)CI大于1，兩種藥物之間為拮抗作用。(3)絲裂霉素和吉西他濱同時(shí)用藥時(shí)抑制率最高，其次是先用絲裂霉素后用吉西他濱，抑制率最低是先用吉西他濱后用絲裂霉素。(4)絲裂霉素和不同濃度的吉西他濱合用，除與2.5 μg/ml吉西他濱合用時(shí)CI＞1外，其余均＜1。10 μg/ml吉西他濱和不同濃度的絲裂霉素合用，除與0.0625 μg/ml合用時(shí)CI＞1外，其余均＜1。(5)絲裂霉素和吉西他濱單用和合用時(shí)對(duì)細(xì)胞周期和凋亡均有影響。結(jié)論 絲裂霉素和吉西他濱單獨(dú)和聯(lián)合用藥可濃度依賴性抑制A549細(xì)胞的生長(zhǎng)。不同用藥次序和藥物濃度比例也影響藥物聯(lián)合作用。

吉西他濱;絲裂霉素;人肺癌A549;中效原理

腫瘤是一群失去正常生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制，發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的自身細(xì)胞，其在人群中發(fā)病率高，全世界每年死于惡性腫瘤的患者高達(dá)數(shù)百萬(wàn)人［1］，人們提出了多種治療方法包括手術(shù)治療、放療、化療、免疫治療等，其中化學(xué)治療仍是主要的治療方式，但是化學(xué)治療也受到選擇性低、不良反應(yīng)大、耐藥性等因素的限制，為了避免上述的缺點(diǎn)，采用合理的聯(lián)合用藥方式對(duì)腫瘤的治療更具潛力。然而采用哪些藥物，劑量怎么搭配等以往多憑經(jīng)驗(yàn)。由于抗腫瘤藥物的療效差異很大，不同組織類型腫瘤對(duì)同一種藥物反應(yīng)不一致。因此在化療前進(jìn)行抗癌藥物敏感性測(cè)試，用中效原理定量分析各抗癌藥物之間的協(xié)同、相加、拮抗作用，將為臨床正確部署抗癌藥物聯(lián)合化療方案提供有價(jià)值的參考［2］。凋亡受阻是腫瘤發(fā)生的主要原因，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡是許多化療藥物抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的主要機(jī)制之一，另外，對(duì)于細(xì)胞周期的干擾也是許多化療藥物主要的作用機(jī)制［3，4］。本實(shí)驗(yàn)中，我們利用中效原理研究了絲裂霉素和吉西他濱聯(lián)合用藥方式對(duì)培養(yǎng)的人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的作用以及對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 酶標(biāo)儀(德國(guó)BMG公司);恒溫CO2培養(yǎng)箱(Kendro公司);電子天平(日本Olympus公司);倒置顯微鏡(江蘇富華儀器廠);恒溫水浴箱(Thermo Forma公司);超低溫冰箱(VILBER LOURMAT公司);VD-1320型潔凈工作臺(tái)(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)發(fā)展有限公司);Millipore純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)。

1.2 藥品 RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司);胰酶(Gibco公司);青霉素(華北制藥集團(tuán)公司);鏈霉素(華北制藥集團(tuán)公司);胎牛血清(Gibco公司);DMSO(Sigma公司);胎盤藍(lán)(哈爾濱譽(yù)衡藥業(yè)有限公司);吉西他濱(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司);絲裂霉素(浙江海正藥業(yè)股份有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞系 人肺癌A549細(xì)胞株由河北醫(yī)科大學(xué)病

理教研室惠贈(zèng)，河北醫(yī)科大學(xué)藥理教研室傳代培養(yǎng)。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng):人肺癌A549細(xì)胞置于含10%小牛血清、100 U/ml青霉素及100 U/ml鏈霉素，pH值為7.2～7.4的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37℃，5%CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。1～2 d傳代1次。

1.4.2 細(xì)胞毒的測(cè)定:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后用1640培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml。按100 μl/孔接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁6 h后，輕輕吸去上清，分別加入所需濃度藥物200 μl，同時(shí)設(shè)不含藥物的陰性對(duì)照孔。每濃度設(shè)6孔，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，在取樣前4 h加入MTT(濃度為 5 g/L，用0.1mol/LPBS 配制)20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，輕輕棄去上清，每孔加入150 μl DMSO，微量振蕩器振蕩10 min，結(jié)晶物充分溶解后，酶標(biāo)儀上測(cè)每孔的570 nm的OD值(OD570)。通過下列公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(Fa):生長(zhǎng)抑制率=(實(shí)驗(yàn)組OD570值-對(duì)照組OD570值)/對(duì)照組OD570值。

吉西他濱藥物濃度為 2.5，5.0，10.0，20.0，40.0 μg/ml;絲裂霉素藥物濃度為 0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0 μg/ml;吉西他濱+絲裂霉素聯(lián)合用藥組藥物濃度為逐一聯(lián)合應(yīng)用，分別為2.5+0.0625、5.0+0.125、10.0+0.25、20.0+0.5、40.0+1.0 μg/ml。

研究不同藥物濃度依賴關(guān)系時(shí)，采用絲裂霉素0.25 μg/ml和不上述同濃度的吉西他濱合用，采用10 μg/ml吉西他濱和上述不同濃度的絲裂霉素合用。

1.4.3 中效劑量(Dm)及合用指數(shù)(CI)的計(jì)算:2個(gè)參數(shù)的計(jì)算參考文獻(xiàn)［5］。

1.4.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布和凋亡率:收集絲裂霉素組、吉西他濱組和聯(lián)合用藥組培養(yǎng)72 h后A549細(xì)胞，胰酶消化后，離心去上清，加PBS將細(xì)胞打勻，轉(zhuǎn)入EP管中，再次離心去上清，加入預(yù)冷70%乙醇固定1 h，PBS洗2次，將等體積的細(xì)胞懸液和PI染液混合，4℃放置30min，混合液過300目尼龍網(wǎng)除去雜質(zhì)，上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 絲裂霉素和吉西他濱單獨(dú)和聯(lián)合用藥可依據(jù)濃度依賴性抑制A549細(xì)胞生長(zhǎng)情況 絲裂霉素在0.0625～1 μg/ml藥物濃度范圍內(nèi)，用藥后72 h時(shí)抑制率增加到10.8% ～46.7%，IC50是1.07 μg/ml(表 1、2和圖 1)。吉西他濱在 2.5～40 μg/ml藥物濃度范圍內(nèi)，用藥后72 h，抑制率增加到7.4% ～47.5%。IC50是49.62 μg/ml(表1、2和 圖2)。聯(lián)合應(yīng)用絲裂霉素和吉西他濱后，在2.5625～41 μg/ml藥物濃度范圍內(nèi)，用藥后72 h時(shí)抑制率增加到 15.0% ～81.1%。IC50為9.68 μg/ml，其 中 含 絲 裂 霉 素 0.23 μg/ml 和 吉 西 他 濱9.45 μg/ml。見表 1、2 和圖 3。

表1 絲裂霉素和吉西他濱單獨(dú)和聯(lián)合用藥72 h后對(duì)人肺癌A549細(xì)胞的作用n=6，±s

表1 絲裂霉素和吉西他濱單獨(dú)和聯(lián)合用藥72 h后對(duì)人肺癌A549細(xì)胞的作用n=6，±s

注:抑制率1:同時(shí)用藥的抑制率;抑制率2:先用絲裂霉素后用吉西他濱;抑制率3:先用吉西他濱后用絲裂霉素時(shí)的抑制率

絲裂霉素 +絲裂霉素劑量(μg/ml)抑制率(%)吉西他濱劑量(μg/ml)抑制率(%)吉西他濱劑量(μg/ml)抑制率1(%)抑制率2(%)抑制率3(%)0.0625 10.8 2.5 7.4 2.5625 15.0 10.9 9.8 0.125 23.9 5 20.4 5.125 39.9 29.8 23.5 0.25 28.7 10 26.1 10.25 52.9 37.8 51.5 0.5 37.4 20 30.2 20.5 70.8 59.2 64.2 1 46.7 40 47.5 41 81.1 77.1 70.8

表2 絲裂霉素和吉西他濱單獨(dú)和聯(lián)合用藥的相關(guān)系數(shù)(r)、斜率(b)、截距(a)和半數(shù)有效濃度(IC50)

圖1 吉西他濱對(duì)A549腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

聯(lián)合用藥72 h后，絲裂霉素的IC50從單用的1.07 μg/ml降低到合用的0.23 μg/ml，降低了78.5%。吉西他濱的IC50從單用的49.62 μg/ml降低到9.45 μg/ml，降低了 81.0%。無(wú)論是絲裂霉素還是吉西他濱在合用后IC50均明顯降低。

2.2 絲裂霉素和吉西他濱聯(lián)合用藥時(shí)的合用指數(shù)CI 在合用72 h后，當(dāng)Fa＞0.18時(shí)，絲裂霉素和吉西他濱合用指數(shù)CI均小于1，兩種藥物之間是協(xié)同作用，當(dāng)Fa＜0.18時(shí)，合用指數(shù)CI大于1，兩種藥物之間為拮抗。見表3、圖4。

圖2 吉西他濱和絲裂霉素聯(lián)合用藥時(shí)在不同抑制率下的合用指數(shù)

圖3 絲裂霉素和吉西他濱聯(lián)合用藥對(duì)人肺癌A549細(xì)胞的作用

表3 絲裂霉素和吉西他濱聯(lián)合用藥時(shí)在不同抑制率下的合用指數(shù)

2.3 絲裂霉素和吉西他濱用藥時(shí)間先后次序依賴關(guān)系 絲裂霉素和吉西他濱同時(shí)用藥時(shí)抑制率最高，其次是先用絲裂霉素，抑制率最低是先用吉西他濱。見表1、圖3。

2.4 絲裂霉素和吉西他濱合用時(shí)不同藥物濃度依賴關(guān)系 絲裂霉素 0.25 μg/ml和不同濃度的吉西他濱合用，除與2.5 μg/ml合用時(shí) CI＞1 外，其余均 ＜ 1.10 μg/ml，吉西他濱和不同濃度的絲裂霉素合用，除與0.0625 μg/ml合用時(shí)CI＞1外，其余均＜1。見表4。

2.5 絲裂霉素和吉西他濱單用或合用時(shí)對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的作用 對(duì)照組細(xì)胞周期各比例分別為:G2/M期22.0%，G0/G1期59.6%，S期6.2%。應(yīng)用0.25 μg/ml絲裂霉素后，G0/G1期和S期降低到21.5%和17.5%，G2/M期細(xì)胞比例升高到69.6%，凋亡率增加到15.9%。應(yīng)用10 μg/ml吉西他濱后，G0/G1和G2/M期降低到53.8%和19.1%，S期細(xì)胞比例升高到27.2%，凋亡率升高24.7%。聯(lián)合用藥后，G0/G1和G2/M期細(xì)胞比例降低到53.6%和12.9%，S期細(xì)胞比例升高到33.3%，凋亡率升高44.7%。見表5、圖5。

3 討論

圖4 絲裂霉素對(duì)A549腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

表4 絲裂霉素和吉西他濱不同劑量聯(lián)合用藥時(shí)的抑制率和合用指數(shù)

表5 絲裂霉素和吉西他濱單獨(dú)或聯(lián)合用藥對(duì)A549細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布的作用n=5，±s

表5 絲裂霉素和吉西他濱單獨(dú)或聯(lián)合用藥對(duì)A549細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布的作用n=5，±s

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05，*P ＜0.01

細(xì)胞周期分布(%)組別 劑量(μg/ml))G0/G1期 G2/M期 S期 凋亡率(%)對(duì)照0 56.5±3.7 22.0±1.2 21.5±2.6 6.2±1.9絲裂霉素 0.25 12.9±2.1# 69.6±1.3# 17.5±1.9* 15.9±1.3#吉西他濱 10 53.8±2.9 19.1±2.8 27.2±3.6+ 24.7±4.2#絲裂霉素+吉西他濱 0.25+10 53.6±3.5 12.9±1.2# 33.5±3.6# 44.7±0.6#

圖5 絲裂霉素和吉西他濱單獨(dú)或聯(lián)合用藥對(duì)A549細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布的作用

由于肺癌沒有有效的普查方法，患者在確診時(shí)已屬中晚期，手術(shù)治療的可能性極低，因此，化療成為延長(zhǎng)肺癌患者生命的重要方法之一，而肺癌單藥化療療效較差，且不良反應(yīng)明顯，合理的聯(lián)合用藥可減輕藥物毒性而療效不減［6］。在本實(shí)驗(yàn)中，我們研究了絲裂霉素和吉西他濱聯(lián)合用藥對(duì)人肺癌A549細(xì)胞的作用，絲裂霉素是一種烷化劑抗癌藥，它的兩個(gè)烷化中心可與DNA形成交叉連接，使細(xì)胞中DNA解聚，抑制DNA復(fù)制，還可引起DNA單鏈斷裂［7］。我們也用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了絲裂霉素對(duì)細(xì)胞周期和凋亡率的影響，流式細(xì)胞術(shù)是一種檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡的確實(shí)可靠的實(shí)驗(yàn)方法［8］，結(jié)果表明，絲裂霉素可濃度依賴性抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，與其使A549細(xì)胞停滯于G2/M期，誘發(fā)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

吉西他濱是一種新型的脫氧胞苷類似物和核苷還原酶抑制劑，對(duì)多種實(shí)體瘤具有良好的抗腫瘤活性，是一種藥物前體，被細(xì)胞攝入后，在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚源x物吉西他濱二磷酸酯或三磷酸酯，可競(jìng)爭(zhēng)性抑制DNA鏈的延長(zhǎng)，導(dǎo)致DNA片段形成和細(xì)胞死亡，發(fā)揮細(xì)胞毒作用［9，10］。我們的研究結(jié)果顯示，吉西他濱可濃度依賴性抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，其機(jī)制與吉西他濱誘發(fā)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

聯(lián)合應(yīng)用絲裂霉素和吉西他濱后，對(duì)A549細(xì)胞的抑制率明顯高于單獨(dú)用藥時(shí)，絲裂霉素和吉西他濱的IC50與單獨(dú)用藥相比也均明顯降低。通過對(duì)CI的分析也表明，當(dāng)Fa＞0.2時(shí)，絲裂霉素和吉西他濱之間呈現(xiàn)協(xié)同作用，＜0.2時(shí)，呈現(xiàn)拮抗作用。這種化療藥物小劑量聯(lián)合呈現(xiàn)拮抗，大劑量出現(xiàn)協(xié)同的現(xiàn)象也曾有報(bào)道［11］。聯(lián)合應(yīng)用絲裂霉素和吉西他濱后，A549細(xì)胞明顯阻滯于S期，而且凋亡率明顯增加。

絲裂霉素和吉西他濱給藥次序不同也影響結(jié)果，研究結(jié)果表明，兩種藥物同時(shí)用藥時(shí)，對(duì)腫瘤細(xì)胞A549的抑制率最高，其次是先用絲裂霉素，這可能與先用細(xì)胞非周期性藥物殺死處于非增殖期的細(xì)胞(G0)，然后用細(xì)胞周期特異性藥物增強(qiáng)療效有關(guān)［12］。

順鉑的作用似烷化劑，主要作用靶點(diǎn)為DNA，干擾DNA的復(fù)制，屬于細(xì)胞周期時(shí)相非特異藥物，只要細(xì)胞處于活化的細(xì)胞周期，藥物就能起作用。隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，活化期的細(xì)胞可被逐漸殺滅，而且處于靜止期(G0)的細(xì)胞活化后進(jìn)入細(xì)胞周期也可被藥物殺滅［13］。我們的研究結(jié)果顯示，順鉑可濃度依賴性抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，其機(jī)制與其阻滯細(xì)胞于G2/M期和誘發(fā)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

吡柔比星是半合成的蒽環(huán)類抗癌藥，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)迅速嵌入DNA核酸堿基對(duì)間，干擾轉(zhuǎn)錄過程，阻止mRNA合成，抑制DNA聚合酶以及DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ活性，干擾DNA合成［14］。我們的研究結(jié)果顯示，吡柔比星可濃度依賴性抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，其機(jī)制與其阻滯細(xì)胞于S期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

聯(lián)合應(yīng)用吡柔比星和順鉑后，對(duì)A549細(xì)胞的抑制率明顯高于單獨(dú)用藥時(shí)，吡柔比星和順鉑的IC50均比單獨(dú)用藥時(shí)均明顯降低。通過對(duì)CI的分析也表明，吡柔比星和順鉑之間呈現(xiàn)協(xié)同關(guān)系。聯(lián)合應(yīng)用吡柔比星和順鉑后，可阻滯細(xì)胞于S期，細(xì)胞凋亡率也明顯增加。

吡柔比星和順鉑給藥次序不同也影響結(jié)果，兩種藥物同時(shí)用藥時(shí)，對(duì)腫瘤細(xì)胞A549的抑制率最高，不同吡柔比星和順鉑濃度比例對(duì)細(xì)胞的抑制率也有明顯的影響。

從本實(shí)驗(yàn)中，我們可以看到，小劑量聯(lián)合應(yīng)用化學(xué)藥物可明顯提高療效;但是，兩藥合用并非藥物濃度越大越好，適宜的濃度比例關(guān)系也是聯(lián)合用藥時(shí)需要考慮的因素。

絲裂霉素和吉西他濱單獨(dú)或聯(lián)合用藥可濃度依賴性抑制A549細(xì)胞的生長(zhǎng)。在合用72 h后，當(dāng)Fa＞0.18時(shí)，兩種藥物之間是協(xié)同作用，當(dāng)Fa＜0.18時(shí)，兩種藥物之間為拮抗。合用時(shí)不同用藥次序和藥物濃度比例也影響藥物聯(lián)合作用。所有藥物的作用均與其誘導(dǎo)凋亡和影響細(xì)胞周期有關(guān)，但對(duì)細(xì)胞周期的影響各不相同。

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The combination effect of gemcitabine with mitomycin on human lung cancer A549 cell line in vitro

ZHAO Kexin，LI Junxia，JIANG Shan，et al．Central Hospital of China Petroleum Natural Gas Group CO．，LTD，Hebei，Langfang065000，China

ObjectiveTo investigate the combination effect of gemcitabine with mitomycin on human lung cancer A549 cell line in vitro，and to explore its action mechanism.MethodsMTT assay was used to analyze the inhibition effect of chemotherapy drugs on the growth of human lung cancer A549 cell line，and the cell cycle and cell apoptosis were detected by flow cytometry.ResultsThe gemcitabine and mitomycin alone or combination application could inhibit the growth of human lung cancer A549 cell line in a time and concentration dependent mode.The combination index(CI)was less than 1 at 72h when Fa＞0.18，which indicated that gemcitabine and mitomycin had synergistic effect.However，the combination index was more than 1 at 72h when Fa ＜ 0.18，which indicated that gemcitabine and mitomycin had antagonistic effect.The combination application of gemcitabine with mitomycin could get the highest inhibitory rate，next，the moderate inhibitory rate was got when mitomycin was given prior to gemcitabine，and the lowest inhibitory rate was got when gemcitabine was given prior to mitocymin.The CI was all less than 1 when mitomycin was combined with gemcitabine at different concentrations.The gemcitabine and mitomycin alone or combination application had influence on the cell cycle and cell apoptosis.ConclusionThe gemcitabine and mitocymin alone or in combination application can inhibit the growth of human lung cancer A549 cell line in a time-and concentration-dependent manner.The different drug concentrations and medication succession may affect the synergistic effect of the drugs.

gemcitabine;mitomycin;human lung cancer A549 cell line;lente principle

R 730.5;R 734.2

A

1002-7386(2011)09-1301-04

10．3969/j．issn．1002-7386．2011．09．007

065000 河北省廊坊市，中國(guó)石油天然氣集團(tuán)公司中心醫(yī)院(趙可新、姜杉、王偉剛、胡建平、單靖珊);河北醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室(李軍霞)

李軍霞，050017 河北醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室;E-mail:lyjunxia@yahoo.com.cn

2011-01-14)

·論著·