王代平,葉華虎,曾 林,白杰英,董 罡,張文韜,聶 奎

(1.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,重慶400715;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,北京100071)

猴B病毒(Monkey B virus),為人獸共患病病原[1]。在自然宿主獼猴體內(nèi)多呈潛伏感染,臨床常見(jiàn)口、生殖器皰疹或呈無(wú)癥狀感染[2],與人感染單純皰疹病毒(HSV)1型和2型類似。人感染猴B病毒后多表現(xiàn)為腦炎、腦脊髓炎,嚴(yán)重的呼吸麻痹甚至死亡,病死率超過(guò)70%,幸存者會(huì)留下神經(jīng)后遺癥[3]。

猴B病毒屬于生物安全(BSL)4級(jí)病原,在自然宿主獼猴中的感染率高(血清學(xué)陽(yáng)性率為10%～60%),并且被感染的獼猴往往終身帶毒[4]。臨床上多采用與猴B病毒同源的人單純皰疹病毒(HSV)、猴因子8(SA8)等病毒蛋白作為診斷抗原進(jìn)行檢測(cè),易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性[5]。糖蛋白gC是猴B病毒高度保守的蛋白之一,研究證實(shí)gC蛋白ELISA診斷的敏感性97.3%,特異性100%,在猴B病毒4種主要被膜蛋白gB、gC、gD和mgG中,僅次于gB。而gB和gD可以與HSV-1、HSV-2的陽(yáng)性血清反應(yīng)。提示gC蛋白可作為猴B病毒診斷的候選抗原[6]。因此,本研究旨在利用密碼子優(yōu)化軟件對(duì)gC蛋白編碼基因序列重新優(yōu)化設(shè)計(jì),替換了大腸埃希菌稀有密碼子,采用重疊PCR(overlapping PCR)方法合成目的基因,并高效表達(dá)重組gC蛋白,為進(jìn)一步建立檢測(cè)猴B病毒抗體間接ELISA方法及研制猴B病毒核酸疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒 原核表達(dá)載體pET-28b(+)質(zhì)粒為美國(guó)Novagen公司產(chǎn)品。宿主菌DH5a和Ecoli BL21感受態(tài)細(xì)胞由西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院傳染病與寄生蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 工具酶和試劑 限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ,HindⅢ,NdeⅠ購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。T4連接酶,質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司。DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自Qiagen公司。兔抗猴IgG-HRP二抗購(gòu)自于Sigma公司。猴B病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和陰性血清由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 猴B病毒gC蛋白胞外區(qū)編碼序列的優(yōu)化及合成 根據(jù)GenBank公布的猴B病毒E2490株gC蛋白的堿基序列,運(yùn)用密碼子優(yōu)化軟件,根據(jù)密碼子簡(jiǎn)并性和偏向性原理,在不改變氨基酸序列的前提下,替換大腸埃希菌稀有密碼子為高頻密碼子,在合成片段兩端添加NdeⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn),通過(guò)全基因合成,并連接pGM-T載體,測(cè)序鑒定。

1.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET28b(+)-gC的構(gòu)建 對(duì)pGMT-gC進(jìn)行雙酶切(NdeⅠ和HindⅢ),回收目的片段,插入pET-28b(+)載體,形成重組質(zhì)粒pET28b(+)-gC,轉(zhuǎn)化DE3大腸埃希菌,經(jīng)抗性篩選、PCR和酶切等方法鑒定陽(yáng)性菌落。

1.2.3 重組gC蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及可溶性分析挑選鑒定后的陽(yáng)性菌落,在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng),至OD600值達(dá)0.6左右時(shí),加入IPTG(1 mmol/L)誘導(dǎo)進(jìn)行表達(dá)。SDS-PAGE分析目的蛋白的表達(dá)以及表達(dá)形式鑒定(分泌型或包涵體)。參照GE Healthcare公司HisPrep FF16/10說(shuō)明書,進(jìn)行重組蛋白的純化。

1.2.4 重組蛋白的Western blot鑒定 純化后的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳,以BIO-RAD半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)轉(zhuǎn)膜(PVDF)。用含50 g/L脫脂奶粉的PBS 4℃封閉過(guò)夜。PBST洗PVDF膜,分別以50倍稀釋的B病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清37℃孵育1 h;PBST洗膜3×5 min;再以1∶2 000稀釋的兔抗猴IgG-HRP孵育,37℃孵育1 h;PBST洗膜3×5min;最后用DAB進(jìn)行顯色。

1.2.5 特異性鑒定 以重組蛋白為抗原,采用方陣實(shí)驗(yàn)確定抗原包被濃度及血清工作濃度,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗猴IgG以1∶25 000稀釋,OPD顯色。(結(jié)果判定:陽(yáng)性血清OD490nm值0.5以上,陰性血清OD490nm值0.1以下,P/N值＞2.1)。采用ELISA檢測(cè)方法對(duì)HSV-I、HSV-II、BV陽(yáng)性血清和陰性血清進(jìn)行特異性檢測(cè),同時(shí)設(shè)陰性和陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 猴B病毒C蛋白稀有密碼子分析結(jié)果

猴B病毒gC基因編碼區(qū)稀有密碼子的分布情況見(jiàn)圖1,稀有密碼子的出現(xiàn)頻率高達(dá)17%,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 猴B病毒gC基因稀有密碼子分析Table 1 Rare codon analysis of monkey B virus-gC gene

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28b(+)-gC的構(gòu)建

通過(guò)化學(xué)合成法獲得gC蛋白胞外區(qū)序列,片段大小為1 200 bp,與預(yù)期大小相符。測(cè)序結(jié)果表明其序列與優(yōu)化過(guò)的序列完全一致。用NdeⅠ和HindⅢ雙酶切pET28b(+)-gC,分別得到約為5 300 bp和1 200 bp的片段,酶切鑒定與預(yù)期相符(圖1)。

圖1 重組質(zhì)粒pET-28b(+)-gC的雙酶切鑒定Fig.1 Enzyme digetion analyses of the recombinant plasmid pET-28b(+)-gC

2.3 重組質(zhì)粒pET-28b(+)-gC的誘導(dǎo)表達(dá)

重組菌誘導(dǎo)后,在約50 ku處出現(xiàn)蛋白條帶,與預(yù)期重組蛋白的分子質(zhì)量一致(圖2A)。對(duì)裂解誘導(dǎo)表達(dá)菌株,進(jìn)一步分析表明,重組蛋白存在于裂解菌沉淀,以包涵體形式存在。凝膠圖像分析顯示,表達(dá)的蛋白約占菌體總蛋白的30%左右。采用Ni-NTA親和層析柱純化目的蛋白,SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果表明純化蛋白為單一條帶(圖2B),表明純化效果較佳。

2.4 重組蛋白Western blot鑒定

以猴B病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清對(duì)純化后的重組蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè),結(jié)果顯示在大小約50 ku處出現(xiàn)一清晰的特異性反應(yīng)條帶(圖3),表明重組蛋白可被猴B病毒陽(yáng)性血清識(shí)別。

2.5 特異性鑒定

將純化的gC重組蛋白作為包被抗原,經(jīng)方陣滴定確定抗原最佳包被量為150 ng/孔,血清稀釋度為1∶10。以建立的ELISA方法檢測(cè)與B病毒同屬的單純皰疹病毒的陽(yáng)性血清,其P/N均小于2.1(表2),表明重組蛋白具有良好的特異性。

圖2 SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白表達(dá)Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant protein

圖3 重組蛋白的Western blot分析Fig.3 Western blot analysis of recombinant protein

表2 ELISA檢測(cè)的特異性試驗(yàn)Table 2 The specificity assay of gC protein by ELISA

3 討論

本試驗(yàn)最初采用PCR技術(shù)以猴B病毒基因組DNA為模板成功擴(kuò)增出編碼gC蛋白胞外區(qū)的基因,克隆到表達(dá)載體pET-28b(+),鑒定和篩選出含gC胞外區(qū)基因的重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株E.coli BL21(DE3),優(yōu)化表達(dá)條件,未見(jiàn)蛋白表達(dá)。之后,我們對(duì)糖蛋白gC的胞外區(qū)基因片段進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)含有較多稀有密碼子ccc、cgg、gga等,有研究證實(shí),這些稀有密碼子在大腸埃希菌中缺乏相應(yīng)的tRNA,大量或連續(xù)出現(xiàn)可能會(huì)使蛋白表達(dá)量降低甚至不表達(dá)[7-8]。我們根據(jù)原核細(xì)胞對(duì)密碼子的偏愛(ài)性,化學(xué)合成糖蛋白gC的胞外區(qū)基因序列[9],將其克隆入載體pET-28b(+),轉(zhuǎn)化DE3菌株,優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件獲得gC蛋白表達(dá)[10]。免疫印跡試驗(yàn)證實(shí),猴B病毒陽(yáng)性血清和抗His單克隆抗體,能特異性的識(shí)別重組蛋白。結(jié)果表明,原核表達(dá)的猴B病毒gC蛋白具有良好的抗原性。

目前,常用與猴B病毒同源的人單純皰疹病毒(HSV)作為診斷抗原,這種檢測(cè)方法,盡管不存在嚴(yán)重的安全隱患,但極大的影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性[11]。近幾年,國(guó)內(nèi)已有利用基因工程技術(shù)構(gòu)建猴B病毒重組囊膜蛋白,并對(duì)其抗原性加以研究的報(bào)道,肖鏡等[12]表達(dá)了猴B病毒gD蛋白片段,并證實(shí)重組蛋白具有良好的抗原性。本試驗(yàn)構(gòu)建的gC重組蛋白,以Western blot驗(yàn)證重組蛋白的抗原性,并初步建立了檢測(cè)猴B病毒抗體的ELISA方法[13],為有效防控猴B病毒感染提供可行的診斷方法,也為進(jìn)一步為凈化猴群奠定了基礎(chǔ)。

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