楊幼聰,張彥明,康 愷,向 華,湯智慧,張三東

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動醫(yī)學(xué)院,陜西楊陵712100)

豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)屬于黃病毒科瘟病毒屬成員,為單股正鏈RNA病毒[1]。CSFV基因組含有一個(gè)大的讀碼框,編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白(Cp(14)、Erns(gp48)、E1(gp33)和E2(gp53))和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(Npro、P7、NS2-3(p125)、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。Lackner T等[2]發(fā)現(xiàn)CSFV NS2蛋白具有自身蛋白酶(autoprotease)活性,其與宿主細(xì)胞中的分子伴侶Jiv90相互作用后,NS2蛋白發(fā)揮蛋白酶活性,將NS2-3切割為NS2和NS3。NS2蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)宿主細(xì)胞阻滯于S期,能夠促進(jìn)Cyclin A蛋白被蛋白酶體快速降解而抑制細(xì)胞的增殖[3]。CSFV NS2蛋白也能夠引起宿主細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-к B信號通路[3]。研究發(fā)現(xiàn)CSFV在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的增殖良好,NS2蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)中,而且CSFV的感染能夠顯著上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子integrin β3的表達(dá),NS2蛋白在其中起著重要的作用[4]。CSFV NS2蛋白通過激活NF-к B的活性上調(diào)趨化因子IL-8和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá),同時(shí)NS2蛋白的表達(dá)能夠?qū)沟鞍酌阁w抑制劑MG132對NF-к B的活性和IL-8表達(dá)的抑制作用,并能夠?qū)筂G132誘導(dǎo)正常血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡效應(yīng),這種抗凋亡作用與NS2蛋白能夠上調(diào)宿主細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2及integrin β3的表達(dá)相關(guān)[5]。西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院畜禽疫病防治與畜產(chǎn)品安全實(shí)驗(yàn)室也以CSFV NS2-C363為誘餌蛋白通過酵母雙雜交方法,從豬血管內(nèi)皮細(xì)胞cDNA文庫中篩選到12個(gè)與豬瘟病毒NS2蛋白互作用的陽性克隆。

本試驗(yàn)構(gòu)建CSFV NS2-C363基因的原核表達(dá)載體,并對其表達(dá)情況進(jìn)行了研究,以期為下一步制備NS2蛋白的單克隆抗體奠定基礎(chǔ),同時(shí)為進(jìn)一步研究NS2蛋白與宿主細(xì)胞蛋白之間的相互作用提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 E.coli DH5α、BL21菌株、原核表達(dá)載體pET-32a和CSFV石門株NS2真核表達(dá)載體,均由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院畜禽疫病防治與畜產(chǎn)品安全實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要酶及試劑 限制性內(nèi)切酶HindⅢ、Bam HⅠ、T4 DNA連接酶以及PCR反應(yīng)試劑、膠回收試劑盒等購自寶生物工程(大連)有限公司;ECL發(fā)光試劑盒為上海炎炎彬化工科技有限公司產(chǎn)品;兔抗His單抗、羊抗兔IgG-HRP為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 根據(jù)CSFV石門株的基因序列(AF092448),用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)了NS2 3′端的基因擴(kuò)增的特異性引物,上下游引物5′端分別引入了HindⅢ、BamHⅠ限制性酶切位點(diǎn)(下劃線部分)。上游引物P1:為5′-CATATGGGATCCTTGGT TGGCTTAGTCAAGGC ,下游引物P2:為5′-CAT TTAAAGCTT TCTAAGCACCCAGCCAAGG。引物由南京金斯瑞生物科技公司合成。

1.2.2 PCR反應(yīng) 以CSFV石門株NS2真核表達(dá)質(zhì)粒為模板,使用特異性引物P1和P2進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為:95℃5 min;95℃30 s,65℃40 s,72℃30 s,共35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.3 原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a的構(gòu)建及鑒定將目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、膠回收后,與pET-32a表達(dá)載體分別用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切,然后用T4 DNA連接酶連接,轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,挑取白色單克隆于含氨芐霉素抗性的LB培養(yǎng)液中37℃振蕩過夜,提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切及測序鑒定。

1.2.4 CSFV石門株NS2-C363基因在大腸埃希菌中的表達(dá) 將pET-NS2-C363轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸埃希菌BL21,涂布于含Amp+(100 μ g/mL)的LB平板上,37℃培養(yǎng)過夜,次日挑取單菌落,于5 mL LB液體培養(yǎng)基中,37℃搖床振蕩(200 r/min)過夜培養(yǎng)。

1.2.5 NS2-C363蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與可溶性分析

1.2.5.1 不同濃度的IPTG對NS2-C363蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)分析 將菌液按1∶100接種于6 mL含有Amp+100 μ g/mL)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6時(shí),加入IPTG至終濃度分別為0.25、0.5、0.75、1.0 mmol/L,37℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h～5 h,收獲細(xì)菌,然后進(jìn)行SDSPAGE分析。

1.2.5.2 不同時(shí)間對PET-NS2-C363蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)分析 將凍存菌液按1∶100擴(kuò)大接種于6 mL含有Amp+(100 μ g/mL)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6時(shí),加入IPTG至終濃度0.5 mmol/L,37℃誘導(dǎo)表達(dá)3、4、5、6、7 h,收獲細(xì)菌,然后進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.5.3 表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析 將凍存菌液按1∶100擴(kuò)大接種于6 mL含有Amp+(100 μ g/mL)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6時(shí),加入IPTG至終濃度0.5 mmol/L,37℃誘導(dǎo)表達(dá)7 h,收獲細(xì)菌,以PBS重懸菌體,超聲破菌。分別收集上清和沉淀,取上述各樣品做SDS-PAGE電泳檢測表達(dá)情況。

1.2.6 Western blot檢測 表達(dá)蛋白的電泳同

1.2.5。電泳結(jié)束后用Bio-Rad電轉(zhuǎn)移裝置將其轉(zhuǎn)印于PVDF膜上(半干轉(zhuǎn)膜法100 V,1.5 h),轉(zhuǎn)印結(jié)束后,按常規(guī)方法進(jìn)行Western blot,一抗為鼠源抗His標(biāo)簽的抗體(1∶3 000倍稀釋),二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(體積比1∶4 000倍稀釋),最后用DAB顯色。

2 結(jié)果

2.1 CSFV石門株NS2 3′端基因的PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增片段長度約為363 bp(圖1),與預(yù)期的基因片段大小相符。

2.2 重組原核表達(dá)載體pET-NS2-C363的鑒定

重組原核表達(dá)載體pET-NS2-C363經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindⅢ、BamHⅠ雙酶切,獲得5 900 bp和363 bp的片段,與預(yù)期大小相符(圖2)。將酶切鑒定正確的陽性菌株送至南京金斯瑞生物科技公司測序。結(jié)果表明,序列完全正確,無突變,無缺失。

2.3 不同濃度IPTG對PET-NS2-C363蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)分析

加入IPTG至終濃度分別為1.0、0.75、0.5、0.25 mmol/L,37℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h收菌,然后進(jìn)行SDS-PAGE分析?？梢娫囼?yàn)范圍內(nèi)IPTG的濃度對蛋白表達(dá)沒有顯著影響(圖3)。

2.4 不同誘導(dǎo)時(shí)間對PET-NS2-C363蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)分析

加入IPTG至終濃度0.5 mmol/L,37℃誘導(dǎo)表達(dá)3、4、5、6、7 h后收獲細(xì)菌,然后進(jìn)行SDS-PAGE分析。可見誘導(dǎo)7 h后目的蛋白的表達(dá)量達(dá)高峰(圖4)。

2.5 PET-NS2-C363蛋白的可溶性分析

重組質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后分別收集上清和沉淀,經(jīng)SDS-PAGE檢測,融和蛋白主要以包涵體形體存在于沉淀中,上清中也有少量的融和蛋白(圖5)。

2.6 融合蛋白pET-NS2-C363蛋白的Western blot檢測

融合蛋白pET-NS2-C363的Western blot檢測結(jié)果見圖6。

圖1 NS2 3′端基因PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR products for 3'end of NS2 gene

圖2 重組質(zhì)粒pET-NS2-C363的酶切鑒定 Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET-NS2-C363 by enzyme digestion

圖3 SDS-PAGE檢測pET-NS2-C363的在不同IPTG濃度情況下的表達(dá)Fig.3 Detection of pET-NS2-C363 expression induced with IPTG of different concentrations by SDS-PAGE

圖4 SDS-PAGE檢測pET-NS2-C363在不同時(shí)間 下的表達(dá)Fig.4 Detection of pET-NS2-C363 ex pression in different time by SDS-PAGE

圖5 PET-NS2-C363蛋白的可溶性分析Fig.5 Solubility analysis of PET-NS2-C363 protein

圖6 pET-NS2-C363重組蛋白Western blot檢測Fig.6 Fusion protein pET-NS2-C363 detection by Western blot

3 討論

CSFV NS2基因全長為1 371 bp,共編碼457個(gè)氨基酸,蛋白的分子質(zhì)量約為53 ku,研究表明CSFV NS2蛋白定位于細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,至少含有2個(gè)內(nèi)部信號肽序列、4個(gè)跨膜區(qū)。目前普遍認(rèn)為NS2僅具有自身蛋白酶活性在NS2/NS3蛋白的自我酶解過程發(fā)揮作用,這一過程病毒的復(fù)制至關(guān)重要[5-6]。唐青海等人的研究表明,CSFV NS2蛋白能夠誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于S期[3],對豬血管內(nèi)皮細(xì)胞(SUVEC)的增殖活性具有一定的抑制作用,能夠上調(diào)SUVEC表面黏附分子integrin β3、趨化因子IL-8、抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。同時(shí)CSFV NS2蛋白能夠引起宿主細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-к B信號通路。CSFV NS2蛋白不僅對病毒的復(fù)制具有間接輔助作用,而且其在病毒誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中也扮演中重要角色,該蛋白在CSFV的持續(xù)感染中亦可能具有重要作用。其是病毒與宿主的相互關(guān)系、病毒編碼蛋白與宿主細(xì)胞內(nèi)分子之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)、病毒編碼蛋白和宿主分子對病毒生活周期的調(diào)控機(jī)制等方面的研究才剛剛起步。以上問題的解決需要應(yīng)用抗NS2的抗體,然而,由于NS2蛋白極易降解,而且其對細(xì)菌具有毒性,所以,目前還沒有針對NS2蛋白的商品化的單克隆抗體[7],這給進(jìn)一步研究帶來的一定的困難。所以本研究并沒有用NS2全長只選取了NS2基因C端的一部分作為原核表達(dá)。

我們實(shí)驗(yàn)室以CSFV NS2-C363為誘餌蛋白通過酵母雙雜交方法從豬血管內(nèi)皮細(xì)胞cDNA文庫中篩選到12個(gè)與CSFV NS2-C363蛋白互作用的陽性克隆。鑒于酵母雙雜交系統(tǒng)的假陽性,需要進(jìn)一步的驗(yàn)證具體哪些蛋白與NS2-C363蛋白相互作用。故需要NS2-C363蛋白作為研究材料對相互作用的蛋白進(jìn)行下一步的驗(yàn)證。

重組蛋白經(jīng)Western blot檢測證明,目的蛋白能與標(biāo)簽蛋白結(jié)合并與特異性抗體結(jié)合,具有良好的抗原性,為下一步制備抗體和純化NS2-C363蛋白奠定了基礎(chǔ)。

[1] Francki R,Fauguet C M,Knudson D,et al.Flaviviridae[J].Arch Virol Suppl,1991,2:223-233.

[2] Lackner T,Thiel H J,Tautz N.Dissection of a viral autoprotease elucidates a function of a cellular chaperone in proteolysis[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(5):1510-1515.

[3] Tang Q H,Zhang Y M,Fan L,et al.Classic swine fever virus NS2 protein leads to the induction of cell cycle arrest at S-phase and endoplasmic reticulum stress[J].J Virol,2010,7:4.

[4] Tang Q H,Zhang Y M,Xu Y Z,et al.Up-regulation of integrin beta 3expression in porcine vascular endothelial cells cultured in vitro by classical swine fever virus[J].Vet Immunol Immunopathol,2010,113:237-242.

[5] Agapov E V,Murray C L,Frolov I,et al.Uncleaved NS2-3 is required for production of infectious bovine viral diarrhea virus[J].J Virol,2004,78(5):2414-2425.

[6] Moulin H R,Seuberlich T,Bauhofer O,et al.Nonstructural proteins NS2-3 and NS4A of classical swine fever virus:essential features for infectious particle formation[J].Virology,2007,365(2):376-389.

[7] Lackner T,Thiel H J,Tautz N.Dissection of a viral autoprotease elucidates a function of a cellular chaperone in proteolysis[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(5):1510-1515.

[8] Peter K,Karl-Josef D.Identification of DNA-binding proteins and protein-protein interactions by yeast one-hybrid and yeast two-hybrid screen[J].Methods Mol Biol,2010,639:171-192.

[9] 孔 建,沈君豪,黃 勇,等.甲型H1N1流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1與人CPSF30結(jié)合拮抗劑篩選模型的建立及藥物篩[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2010,45(3):388-394.

[10] Pajunen M,Poussu E,Turakainen H,et al.Application of Mu in vitro transposition for high-precision mapping of protein-protein interfaces on a yeast two-hybrid platform[J].Methods,2009,49(3):255-262.

[11] Ilya S.Yeast two-hybrid system for studying protein-protein interactions-stage 1:Construction and characterization of a bait protein[J].Cold Spring Harb Protoc,2010(5):5429.