江運(yùn)長(zhǎng) 彭清華 楊 霞

視網(wǎng)膜激光光凝術(shù)已成為治療糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞等常見(jiàn)眼底病的重要手段，并取得較好的治療效果。但是，視網(wǎng)膜激光光凝在發(fā)揮其治療作用的同時(shí)，本身也是一種病理過(guò)程，可對(duì)視網(wǎng)膜的正常結(jié)構(gòu)和功能造成一定的影響，導(dǎo)致視網(wǎng)膜激光損傷。因此需要研究視網(wǎng)膜激光光凝的輔助性療法，以期減輕眼底激光治療的副作用，促進(jìn)損傷修復(fù)，增強(qiáng)其療效。我們采用兔視網(wǎng)膜激光損傷模型作為研究對(duì)象，研究益氣活血法對(duì)眼底激光視網(wǎng)膜損傷的促修復(fù)作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康有色家兔50只，雌雄不限，體質(zhì)量為2.0～2.5 kg，均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，使用條件符合國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，所有動(dòng)物檢查均無(wú)眼部疾病。

1.2 主要藥品與儀器 黃芪水煎液(生藥濃度: 1 kg·L-1)、蠐螬水提液(生藥濃度:0.25 kg· L-1)、益氣活血方(黃芪、當(dāng)歸、紅花等)水煎液(生藥濃度:1 kg·L-1);膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)一抗、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)一抗(武漢博士德生物工程有限公司);S-P免疫組織化學(xué)染色超敏試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);Imaging ProPlus圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)Media Cybernetic公司);光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯株式會(huì)社);眼底激光治療儀(法國(guó)光太公司)。

1.3 造模方法 參照覃冬菊等［1］提出的方法，并加以改進(jìn)。采用倍頻532 nm綠激光對(duì)有色家兔眼進(jìn)行損傷照射造模。照射前，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用5 g·L-1復(fù)方托品酰胺滴眼液滴眼散瞳，250 g·L-1烏拉坦4 mL·kg-1耳緣靜脈注射麻醉。每眼照射40個(gè)損傷斑。光斑直徑50 μm，照射功率110 mW，曝光時(shí)間0.15 s。

1.4 分組及給藥方法 50只家兔隨機(jī)分成正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、黃芪組、蠐螬組、益氣活血組，每組10只。黃芪組每天給予黃芪水煎液5 mL·kg-1灌胃;蠐螬組每天給予蠐螬水提液5 mL·kg-1灌胃;益氣活血組每天給予益氣活血方水煎液5 mL·kg-1灌胃;正常對(duì)照組、模型對(duì)照組給予等量生理鹽水灌胃。于造模后第2天開(kāi)始灌胃，每天1次。

1.5 觀測(cè)指標(biāo) bFGF、GFAP表達(dá)的免疫組織化學(xué)觀察:切片經(jīng)常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水后，采用S-P免疫組織化學(xué)法檢測(cè)視網(wǎng)膜組織bFGF、GFAP的表達(dá)。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，封片。正常對(duì)照組與模型對(duì)照組省去滴加bFGF、GFAP一抗的步驟。

2 結(jié)果

2.1 益氣活血法對(duì)bFGF表達(dá)的影響 術(shù)后第7天，正常對(duì)照組視網(wǎng)膜組織切片bFGF呈陽(yáng)性表達(dá)(圖1)。模型對(duì)照組、黃芪組、蠐螬組陽(yáng)性表達(dá)范圍均較正常對(duì)照組小(圖2-圖4)。益氣活血組bFGF陽(yáng)性表達(dá)范圍較模型對(duì)照組、黃芪組、蠐螬組大(圖5)。正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、黃芪組、蠐螬組及益氣活血組視網(wǎng)膜bFGF表達(dá)的灰度值分別為84.54± 15.16、134.00±15.94、128.72±12.47、128.94± 9.50及105.16±5.17。模型對(duì)照組視網(wǎng)膜組織bFGF表達(dá)與正常對(duì)照組比較明顯減少(P＜0.05);與其他激光損傷組比較，益氣活血組bFGF表達(dá)均明顯增強(qiáng)(均為P＜0.05)，但還未恢復(fù)到正常對(duì)照組水平。提示益氣活血方劑可以增加內(nèi)源性bFGF的表達(dá)，從而發(fā)揮其保護(hù)作用。

Figure 1 The positive expression of bFGF in the normal control group(×400).Figure 2 Compared with the normal control group，the expression of bFGF in model group decreased(×400).Figure 3 Compared with the normal control group，the expression of bFGF in astragalus group decreased (×400).Figure 4 Compared with the normal control group，the expression of bFGF in grub group decreased(×400).Figure 5 Compared with the other injury groups，the expression of bFGF in yiqihuoxuefang group increased(×400) 圖1 正常對(duì)照組視網(wǎng)膜組織切片bFGF呈陽(yáng)性表達(dá)(×400)。圖2 模型對(duì)照組bFGF表達(dá)較正常對(duì)照組弱(×400)。圖3 黃芪組bFGF表達(dá)較正常對(duì)照組弱(×400)。圖4 蠐螬組bFGF表達(dá)較正常對(duì)照組弱(×400)。圖5 益氣活血組bFGF表達(dá)較其他激光損傷組強(qiáng)(×400)

術(shù)后第14天，正常對(duì)照組視網(wǎng)膜組織切片bFGF呈陽(yáng)性表達(dá)，與術(shù)后第7天相比，無(wú)明顯區(qū)別。模型對(duì)照組、黃芪組、蠐螬組 bFGF繼續(xù)呈陽(yáng)性表達(dá)。益氣活血組bFGF陽(yáng)性表達(dá)持續(xù)，陽(yáng)性表達(dá)范圍仍然較模型對(duì)照組、黃芪組、蠐螬組增加。正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、黃芪組、蠐螬組及益氣活血組視網(wǎng)膜bFGF表達(dá)的灰度值分別為81.30±18.11、136.00± 14.41、122.00±6.64、126.98±7.97及102.12±7.79。模型對(duì)照組視網(wǎng)膜組織bFGF表達(dá)與正常對(duì)照組比較明顯減少(P＜0.05);與其他激光損傷組比較，益氣活血組bFGF表達(dá)明顯增強(qiáng)(均為P＜0.05)，但還未恢復(fù)到正常對(duì)照組水平(P＜0.05)。提示益氣活血方劑可以增加內(nèi)源性bFGF的表達(dá)，繼續(xù)發(fā)揮其保護(hù)作用。

2.2 益氣活血法對(duì)GFAP表達(dá)的影響 術(shù)后第7天，正常對(duì)照組視網(wǎng)膜組織切片Müller細(xì)胞的GFAP呈陰性表達(dá)，星型膠質(zhì)細(xì)胞 GFAP呈陽(yáng)性表達(dá)(圖6)。模型對(duì)照組、黃芪組、蠐螬組GFAP呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)范圍較正常對(duì)照組大(圖7-圖9)。益氣活血組GFAP陽(yáng)性表達(dá)范圍較正常對(duì)照組大，但較模型對(duì)照組、黃芪組、蠐螬組小(圖10)。正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、黃芪組、蠐螬組及益氣活血組視網(wǎng)膜GFAP表達(dá)的灰度值分別為141.72±12.30、91.44±13.39、90.22±15.59、84.14±25.04及119.08±6.92。模型對(duì)照組視網(wǎng)膜組織GFAP表達(dá)與正常對(duì)照組比較明顯增強(qiáng)(P＜0.05);與其他激光損傷組比較，益氣活血組GFAP表達(dá)明顯減少(均為P＜0.05)，但較正常對(duì)照組明顯增強(qiáng)(P＜0.05)，提示益氣活血方劑有利于激光視網(wǎng)膜損傷的適度修復(fù)。

Figure 6 The positive expression of GFAP in the normal control group(×400).Figure 7 Compared with the normal control group，the expression of GFAP in model group increased(×400).Figure 8 Compared with the normal control group，the expression of GFAP in astragalus group increased (×400).Figure 9 Compared with the normal control group，the expression of GFAP in grub group increased(×400).Figure 10 Compared with the other injury groups，the expression of GFAP in yiqihuoxuefang group decreased(×400) 圖6 正常對(duì)照組的GFAP呈陽(yáng)性表達(dá)(×400)。圖7模型對(duì)照組GFAP陽(yáng)性表達(dá)較正常對(duì)照組強(qiáng)(×400)。圖8 黃芪組GFAP陽(yáng)性表達(dá)較正常對(duì)照組強(qiáng)(×400)。圖9 蠐螬組GFAP陽(yáng)性表達(dá)較正常對(duì)照組強(qiáng)(×400)。圖10 益氣活血組GFAP陽(yáng)性表達(dá)較其他激光損傷組弱(×400)

術(shù)后第14天正常對(duì)照組視網(wǎng)膜組織切片GFAP表達(dá)與術(shù)后第7天相比，無(wú)明顯區(qū)別。模型對(duì)照組、黃芪組、蠐螬組GFAP呈持續(xù)陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)范圍較正常對(duì)照組大。益氣活血組GFAP陽(yáng)性表達(dá)范圍仍然較正常對(duì)照組大，但較模型對(duì)照組、黃芪組、蠐螬組小。正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、黃芪組、蠐螬組及益氣活血組視網(wǎng)膜GFAP表達(dá)的灰度值分別為136.68±7.61、92.30±11.79、92.18±15.28、86.66± 22.62及117.66±5.30。模型對(duì)照組視網(wǎng)膜組織GFAP表達(dá)與正常對(duì)照組比較明顯增強(qiáng)(P＜0.05);與其他激光損傷組比較，益氣活血組GFAP表達(dá)明顯減少(均為P＜0.05)，但較正常對(duì)照組明顯增強(qiáng)(P＜0.05)，提示益氣活血方劑有利于激光視網(wǎng)膜損傷的適度修復(fù)。

3 討論

眼底激光光凝視網(wǎng)膜可以造成視網(wǎng)膜激光損傷。眼激光損傷藥物防治的研究水平尚停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，還沒(méi)有進(jìn)行臨床應(yīng)用研究［2］，所以，激光視網(wǎng)膜損傷的治療目前尚無(wú)特異性的藥物。在本實(shí)驗(yàn)部分，我們?cè)噲D通過(guò)免疫組織化學(xué)法來(lái)初步了解益氣活血法對(duì)眼底激光視網(wǎng)膜損傷修復(fù)的干預(yù)作用和相應(yīng)機(jī)理。我們發(fā)現(xiàn)，益氣活血方劑能夠增強(qiáng)視網(wǎng)膜組織中bFGF的表達(dá)、抑制GFAP的表達(dá)。

bFGF促進(jìn)損傷修復(fù)的作用已趨于肯定。研究表明，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和光感受器細(xì)胞能合成bFGF，其在視網(wǎng)膜的發(fā)育與生長(zhǎng)中起著重要作用［3］。bFGF對(duì)光感受器具有重要的保護(hù)作用，強(qiáng)光照射和機(jī)械損傷均可引發(fā)這種保護(hù)作用。單清等［4］通過(guò)觀察比較bFGF、地塞米松和維生素C對(duì)動(dòng)物視網(wǎng)膜激光損傷的治療效果，發(fā)現(xiàn)bFGF能維持神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的功能，加速視網(wǎng)膜損傷斑的修復(fù)愈合以及視功能的恢復(fù)。由于bFGF治療后有更多的光感受器存在，揭示其可能在維持光感受器方面有直接作用。本實(shí)驗(yàn)表明，益氣活血方劑可以促進(jìn)內(nèi)源性bFGF的分泌，有利于發(fā)揮bFGF對(duì)光感受器的保護(hù)作用，從而減輕激光對(duì)視網(wǎng)膜的損傷。

GFAP常被作為膠質(zhì)細(xì)胞的特征性標(biāo)記物應(yīng)用于免疫研究。研究表明，Müller細(xì)胞的GFAP表達(dá)與激光光凝損傷程度成正相關(guān)［5］。視網(wǎng)膜損傷發(fā)生后，Müller細(xì)胞增生旺盛，其GFAP合成的量和表達(dá)范圍顯著增加。Müller細(xì)胞的這種過(guò)度增生和肥大將影響光感受器細(xì)胞的再生，導(dǎo)致視網(wǎng)膜自身纖維化，阻礙了視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的恢復(fù)，從而不可避免地對(duì)視功能的恢復(fù)產(chǎn)生不利影響。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，益氣活血方劑可以減少GFAP表達(dá)的量及范圍，提示其能抑制Müller細(xì)胞對(duì)損傷的過(guò)度修復(fù)，起到保護(hù)視細(xì)胞再生與恢復(fù)所需的空間，從而為激光視網(wǎng)膜損傷得到更好的修復(fù)提供形態(tài)結(jié)構(gòu)上的支持。

Humphrey等［5］用視網(wǎng)膜光凝法對(duì)視網(wǎng)膜造成損傷后，發(fā)現(xiàn)了GFAP含量升高而bFGF含量降低的病理改變。由于bFGF抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)元的細(xì)胞凋亡、維持光感受器的生存而減少，隨之Müller細(xì)胞增殖促使視網(wǎng)膜的修復(fù)，表現(xiàn)為GFAP表達(dá)的增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)表明，益氣活血方劑可以同時(shí)增加bFGF的表達(dá)和減少GFAP的表達(dá)，因而能夠改變以上的病理表現(xiàn)，進(jìn)而改變激光視網(wǎng)膜損傷的修復(fù)進(jìn)程，達(dá)到更高層次的修復(fù)。

益氣活血法可能通過(guò)增強(qiáng)視網(wǎng)膜組織中bFGF的表達(dá)、抑制GFAP的表達(dá)，促進(jìn)眼底激光視網(wǎng)膜損傷的修復(fù)，對(duì)視網(wǎng)膜激光光凝損傷有一定的防治作用，可以考慮作為視網(wǎng)膜激光光凝的輔助性療法。

1 覃冬菊，唐羅生，劉湘平，唐朝珍.兔視網(wǎng)膜光凝術(shù)后組織形態(tài)學(xué)改變的動(dòng)態(tài)觀察［J］.國(guó)際眼科雜志，2008，8(5):909-912.

2 李 哲，蔣銘敏.激光眼損傷治療藥物的研究進(jìn)展［J］.激光雜志，2006，27(3):3-4.

3 李 臻.視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子［J］.眼科新進(jìn)展，2004，24(3):234-237.

4 單 清，任 華，張 杰，焦振宇，錢(qián)煥文.激光視網(wǎng)膜損傷治療的實(shí)驗(yàn)研究［J］.激光生物學(xué)報(bào)，2001，10(2):124-127.

5 Humphrey M，Chu Y，Mann K，Rakoczy P.Retinal GFAP and bFGF expression after multiple argon laser photocoagulation injuries assessed by both immunoreactivity and mRNA levels［J］. Exp Eye Res，1997，64(3):361-369.