許 琴 肖煜晨

老年性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)是隨年齡增長(zhǎng)而發(fā)生、發(fā)展的老年人常見(jiàn)的一種致盲眼病,好發(fā)于視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)-Bruch膜-脈絡(luò)膜毛細(xì)血管復(fù)合體以及視網(wǎng)膜外層的退行性病變。AMD分滲出性和干性?xún)尚?滲出性 AMD以脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)為特征。CNV穿過(guò)Bruch膜進(jìn)入視網(wǎng)膜下,導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離、中心視力喪失[1]。CNV的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了,人體和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的各種補(bǔ)體與年齡相關(guān)的黃斑退化關(guān)系緊密[2]。膜攻擊復(fù)合物(membrane attack complex, MAC)是激活的補(bǔ)體級(jí)聯(lián)終產(chǎn)物,國(guó)外報(bào)道在糖尿病眼組織補(bǔ)體MAC沉積增加,可誘導(dǎo)生長(zhǎng)因子釋放,刺激血管壁細(xì)胞增殖,促進(jìn)血管增生性疾病的發(fā)生發(fā)展[3]。MAC是否參與CNV的形成及其作用國(guó)內(nèi)報(bào)道尚少。我們用激光擊破Bruch膜誘導(dǎo)動(dòng)物CNV模型[4],探討補(bǔ)體及MAC在CNV發(fā)生中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與分組 雄性 C57BL/6小鼠 72只, C3-/-小鼠21只(4～6周,The Jackson實(shí)驗(yàn)室)。共聚焦顯微鏡LSM510(Carl Zeiss),FITC-葡聚糖(FITC-dextran,Sigma公司),抗山羊CY3抗體(Sigma公司),單克隆特定抗彈性蛋白抗體(Sigma公司), 10 g·L-1Cyclogyl、托吡卡胺、氯胺酮、二甲苯胺噻嗪、眼鏡蛇毒(Quidel),兔多克隆MAC抗體,FITC-結(jié)合抗兔IgG抗體(Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 激光誘導(dǎo)小鼠CNV形成

1.2.1.1 實(shí)驗(yàn)分組 對(duì)照組C57BL/6小鼠(n= 21)。眼鏡蛇毒素(cobra venom factor,CVF)預(yù)處理組(n=21):激光光凝前2 d,C57BL/6小鼠25μg CVF腹腔注射,激光光凝后每天同劑量注射至激光光凝后第6天。C3-/-小鼠組(n=21)。氪紅激光光凝(光斑直徑50μm,曝光時(shí)間0.05 s,輸出功率為250mW),左眼激光光凝 5～8次,光凝后有氣泡示Bruch膜破裂。

1.2.2 觀察CNV發(fā)生率及大小

1.2.2.1 FITC-dextran心內(nèi)熒光素灌注 激光光凝后第7天麻醉小鼠(每組6只),1 mL含50μg FITC-dextran PBS(pH 7.3)灌注心臟。

1.2.2.2 剝離RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜 處死小鼠,體積分?jǐn)?shù)為 10%福爾馬林液固定眼球,解剖顯微鏡下去除角膜和晶狀體、玻璃體。顯微鏡下將RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體呈 5～6條放射狀切開(kāi)。

1.2.2.3 抗體標(biāo)記Bruch膜及RPE RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜在體積分?jǐn)?shù)為5%牛血清白蛋白中孵育 1 h后, PBS漂洗,滴加單克隆特定抗Elastin抗體(1.0 g· L-1;1∶200稀釋,Sigma-Aldrich),并置于濕盒內(nèi),緩慢搖床上4℃過(guò)夜(避光),PBS漂洗,每次間隔5 min;加入二抗抗山羊CY3抗體(1.0 g·L-1,1∶2 000稀釋)于37℃濕盒避光孵育2 h,PBS漂洗。

1.2.2.4 觀察CNV 激光光凝后第7天,RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體鋪片,共聚焦顯微鏡下觀察CNV的發(fā)生率,在激光光斑處CNV復(fù)合物為綠色,視網(wǎng)膜與Bruch膜呈紅色。

1.2.2.5 免疫組織化學(xué)分析 標(biāo)記RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體的MAC。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組(n=15),激光光凝后第1天、第3天、第5天和第7天后被處死,RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體鋪片滴加兔多克隆抗體(1∶200稀釋) 37℃孵育2 h,PBS漂洗后,加入二抗FITC-結(jié)合抗兔IgG抗體(1∶200稀釋)于37℃孵育1 h,PBS漂洗。

1.2.3 補(bǔ)體的溶血活性(CH50)檢測(cè) 分別收集經(jīng)腹腔注射CVF后的第1天、第3天、第5天和第7天(n=15)及對(duì)照組小鼠血液(n=15),EZ補(bǔ)體CH50實(shí)驗(yàn)(Diamedix)檢測(cè)補(bǔ)體活性。150μL抗體敏感的綿羊紅細(xì)胞與鼠血清梯度稀釋,在 37℃下孵育 60 min。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究使用SPSS 13.0軟件,組間比較采用 t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 眼底改變 雄性C57BL/6小鼠激光后光斑中央有氣泡形成,光凝后觀察眼底見(jiàn)光斑中央為白色。

2.2 CH50檢測(cè)結(jié)果 CVF處理組的C57BL/6小鼠補(bǔ)體與對(duì)照組的C57BL/6小鼠相比,其CH50水平在光凝后第 1天、第 3天、第 5天和第 7天分別為3%、3%、3%和2%,相同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組的CH50水平均為100%,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為 P＜0.001)。結(jié)果表明CVF耗盡C57BL/6小鼠體內(nèi)補(bǔ)體。

2.3 觀察實(shí)驗(yàn)組激光誘導(dǎo)CNV復(fù)合物 經(jīng)FITC-dextran灌注心臟,RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體標(biāo)記呈紅色,共聚焦顯微鏡檢測(cè)鋪片,證實(shí)光凝后第 7天,對(duì)照組小鼠光斑中央有CNV長(zhǎng)出(綠色),發(fā)展為實(shí)驗(yàn)性CNV,由扁平血管構(gòu)成寬大的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖1),可觀察到實(shí)驗(yàn)性CNV與周?chē)}絡(luò)膜之間的交通血管。CVF預(yù)處理組及缺乏補(bǔ)體C3的 C3-/-小鼠組激光不能誘導(dǎo)CNV的生成(圖2-圖3)。

2.4 CNV復(fù)合物區(qū)域MAC的沉積 對(duì)照組C57BL/6小鼠激光后第 1天、第 3天、第 5天、第 7天RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體鋪片見(jiàn)MAC紅色強(qiáng)陽(yáng)性染色(圖4)。CVF預(yù)處理組C57BL/6小鼠和C3-/-小鼠組,激光后第1天、第3天、第5天、第7天,RPE- 脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體鋪片未見(jiàn)MAC染色(圖5-圖6)。

Figure 1 Confocalm icrograph in C57BL/6m ice showed the growth of CNV in control group at the 7th day after laser photocoagulation(The CNV complex stained green,Bruchmembrance and RPE stained red).Figure 2 CNV did notappear in C 57BL/6m ice in CVF-treated group at the 7th day after laser photocoagulation.Figure 3 No CNV appeared in C3-/-group at the 7th day after laser photocoagulation 圖1 激光光凝后第7天,共聚焦顯微鏡下見(jiàn)激光誘導(dǎo)的對(duì)照組C57BL/6小鼠CNV生長(zhǎng)(CNV復(fù)合物呈綠色,Bruch膜及RPE呈紅色)。圖2 激光光凝后第7天,CVF預(yù)處理組C 57BL/6小鼠未見(jiàn)CNV生成。圖3 激光光凝后第7天,C3-/-組小鼠未見(jiàn)CNV生成

Figure 4 Staining for MAC in laser spots(CNV area,especially in RPE)were red in C57BL/6m ince in control group after laser photocoagulation. Figure 5 No staining for MACwas observed in C57BL/6mice in CVF-treated group after laserphotocoagulation.Figure 6 No staining for MACwas observed in C3-/-group after laser photocoagulation 圖4 對(duì)照組C 57BL/6小鼠激光光凝后激光光斑(CNV區(qū)域尤其是RPE)MAC呈紅色。圖5 CVF預(yù)處理組C 57BL/6小鼠,耗盡補(bǔ)體,激光光凝后未觀察到MAC染色。圖6 C3-/-組小鼠激光光凝后未觀察到MAC染色

3 討論

AMD是老年人永久性中心視力喪失的主要原因[1]。CNV是滲出性AMD的一種標(biāo)志,CNV的病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確,可能與增齡性改變、缺氧、缺血、血管生成因子、Bruch膜損傷或細(xì)胞外基質(zhì)改變等多種因素有關(guān)。有報(bào)道稱(chēng)局部炎癥和免疫反應(yīng)引起促新生血管因子增加,導(dǎo)致了 CNV的發(fā)生[5],補(bǔ)體C5b-9復(fù)合物參與 CNV的形成[6],人體和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的各種補(bǔ)體與 AMD關(guān)系緊密[2]。補(bǔ)體MAC是激活的補(bǔ)體級(jí)聯(lián)終產(chǎn)物。在CNV疾病中,補(bǔ)體MAC是否參與CNV的形成及作用機(jī)制國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道。誘發(fā)動(dòng)物 CNV形成的可靠方法之一是激光光凝使Bruch膜破裂。在本研究中,我們用激光誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)鼠CNV模型探討了補(bǔ)體MAC在CNV生成中的作用。

我們?cè)诩す庹T導(dǎo)的CNV小鼠模型中觀察到補(bǔ)體充足的C57BL/6小鼠有CNV形成,而通過(guò)用眼鏡蛇蛇毒因子耗盡補(bǔ)體的C57BL/6小鼠CNV的生成受到嚴(yán)重抑制;我們又發(fā)現(xiàn)激光不能誘導(dǎo)缺乏補(bǔ)體的C3-/-小鼠CNV的生成。這表明,補(bǔ)體存在和活化是激光誘導(dǎo)小鼠 CNV生成的必要條件。正常情況下MAC會(huì)自發(fā)地、少量沉積在自身組織,而病理?xiàng)l件下MAC大量沉積在自身組織。本研究中,我們用激光誘導(dǎo)補(bǔ)體充足的C57BL/6小鼠建立CNV模型,研究發(fā)現(xiàn)在新生血管病變區(qū)域有大量的 MAC沉積,在新生血管復(fù)合物觀察到 MAC強(qiáng)染色。相反,激光對(duì) C3-/-小鼠以及 CVF處理的補(bǔ)體耗盡的C57BL/6小鼠,未見(jiàn)MAC染色。這些結(jié)果表明補(bǔ)體的存在和MAC沉積、激光誘導(dǎo)的CNV生成三者相互關(guān)聯(lián)。MAC是補(bǔ)體級(jí)聯(lián)激活的終產(chǎn)物,國(guó)外報(bào)道MAC可釋放血管生長(zhǎng)因子如VEGF、β-FGF、TGF-β;由MAC介導(dǎo)的有核細(xì)胞釋放的細(xì)胞生長(zhǎng)因子可能是血管生成的致病機(jī)制[7];補(bǔ)體激活抑制劑rsCD59a-Fc通過(guò)阻止MAC沉積和血管生長(zhǎng)因子(VEGF、β-FGF、TGF-β2)釋放途徑抑制激光誘導(dǎo)CNV生成;眼鏡蛇蛇毒因子耗盡補(bǔ)體 CVF[8]導(dǎo)致血管生長(zhǎng)因子水平顯著下降。這些報(bào)道與我們的結(jié)果顯示:補(bǔ)體的存在和活化,尤其是MAC的形成是激光誘導(dǎo)小鼠 CNV形成的重要途徑。補(bǔ)體活化和MAC形成是激光誘導(dǎo)CNV生成的第一個(gè)直接的作用。

由以上可知,我們推測(cè)補(bǔ)體在CNV中可能的作用機(jī)制是補(bǔ)體通過(guò)經(jīng)典或替代途徑激活導(dǎo)致MAC在RPE和(或)脈絡(luò)膜大量的形成和沉積。補(bǔ)體被激活的具體通路不知。激光誘導(dǎo)小鼠 CNV中補(bǔ)體激活具體途徑有待深入研究探討。

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