喬麗萍 孫惠敏 趙少貞 楊 柳 袁佳琴

有學(xué)者認為,準分子激光原位角膜磨鑲術(shù)(laser assisted in-situ keratomileusis,LASIK)后角膜上皮發(fā)生改變的現(xiàn)象可能與屈光回退有一定關(guān)系[1]。共聚焦顯微鏡(confocalm icroscopy,CM)是一種高清晰度、高放大倍率的活體顯微鏡檢查技術(shù)。它可以在活體狀態(tài)下,無創(chuàng)傷、實時地從細胞水平觀察LASIK術(shù)后不同時間點角膜各層組織的動態(tài)變化,直接獲得活體角膜上皮、基質(zhì)及角膜厚度等信息,為研究提供客觀、定量的測量分析數(shù)據(jù)。本研究應(yīng)用 CM對LASIK術(shù)后48例(48眼)患者的角膜上皮厚度進行觀察,旨在評價角膜上皮厚度變化與組織學(xué)改變之間的關(guān)系,現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇 2003年11月至 2006年 1月于武警醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和天津醫(yī)科大學(xué)眼科中心進行LASIK術(shù)的患者48例(48眼),其中男22例,女26例,均為右眼;年齡 18～30歲,平均(24.45± 0.86)歲。術(shù)前等效球鏡值為2.25～-12.50 D,平均(-5.61±2.75)D。按等效球鏡值不同將所有患者分為低中度近視組(≤-6.00 D;21眼)與高度近視組(＞-6.00D;27眼)[2]。納入條件:(1)無軟性或硬性角膜接觸鏡配戴史;(2)未發(fā)現(xiàn)與LASIK術(shù)相關(guān)的并發(fā)癥;(3)無眼外傷史、無眼內(nèi)疾病,如青光眼等;(4)無服用過影響角膜代謝的藥物,如乙胺碘呋酮、異維甲酸等;(5)無全身性疾患,如糖尿病、甲狀腺疾病、活動性膠原血管疾病等;2組患者年齡差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(t=-1.032,P=0.220)。

1.2 檢測方法 所有患者均于術(shù)前進行裸眼視力檢查、散瞳檢影、電腦驗光(auto REF-keratometer, ARK-700,SEED)、眼前節(jié)檢查、角膜地形圖測量角膜曲率(EyemapEH-290,Alcon)、直接或間接檢眼鏡檢查眼底以及CM(Confoscan 3.0,日本NIDEK公司)檢查角膜上皮厚度。主要裝置:12V/100W的鹵素光源和IR(紅外線)、UP(紫外線)濾過器、40× 0.75W∞/0水浸式物鏡、CCD照相機、高速數(shù)碼錄圖像機、PC計算機、LCDS-VGA15顯示器、NAVIS軟件系統(tǒng)。放大倍數(shù)為 1 000;水浸式物鏡的視野為330mm×400 mm;景深 10μm,側(cè)像分辨率 1～2μm,物鏡與角膜的距離為 2 mm;掃描頻率為20 Hz,每次掃描 350幅圖。完成一次掃描需 7 s。每幅圖像大約可見475 mm×350 mm角膜組織,掃描厚度為8μm,背景相對暗度為10DB,并確保物鏡有恒定的掃描速度。本研究采用半自動掃描。

所有患者分別于術(shù)后第 1天、第 3天、第 7天、第 10天、第30天、第 60天、第 90天行最佳遠視力檢查、電腦驗光、角膜地形圖測量角膜曲率及CM檢查角膜厚度。

1.3 手術(shù)方法 采用VISX Laser(VISX,Santa,CA)第三代產(chǎn)品,波長193 nm,固定脈沖頻率為6～8Hz,能量為160 mJ·cm-2。使用自動角膜刀(Moria, M 2)制作預(yù)計厚度150μm,直徑為8.5～9.0 mm的角膜瓣。手術(shù)步驟:(1)沖洗手術(shù)眼,消毒手術(shù)區(qū),表面麻醉,鋪洞巾;(2)制作預(yù)計150μm厚度的角膜瓣;(3)選用6.0mm范圍激光切削;(4)沖洗基質(zhì)床(林格液);(5)復(fù)位角膜瓣。所有手術(shù)均由同一醫(yī)師完成。術(shù)眼均不包扎。術(shù)后 4 h開始滴用妥布霉素滴眼液,每天 4次,共 3 d。每 2天復(fù)診后,雙眼給予 1 g·L-1氟米龍滴眼液滴眼。第 1周每天 4次,第 2周每天 3次,第3周每天 2次,第 4周每天1次,至停止用藥。

1.4 數(shù)據(jù)采集 CM的Z-scan曲線可以通過光強度值的變化來反映角膜新陳代謝狀況。術(shù)后角膜 Z-scan曲線中可以辨認上皮波、Bowman層神經(jīng)纖維叢波、界面波、激活細胞區(qū)域波型、內(nèi)皮波。選擇眼球無側(cè)向運動和前后運動,波形完整的Z-scan曲線用于測量,獲取數(shù)據(jù)。

圖 1中a為表皮波,b為基底細胞層波,c為神經(jīng)纖維叢波,d為最前部基質(zhì)細胞波,e為界面(異常顆粒),f為界面下激活細胞波,g為基質(zhì)細胞波,h為內(nèi)皮波。f波波長為激活細胞的深度。角膜厚度為內(nèi)皮波峰與表皮波峰之間的距離;上皮厚度為表皮波峰與Bowman層神經(jīng)纖維波峰之間的距離;術(shù)后因神經(jīng)纖維叢在制作角膜瓣時被切斷,隨后被激光切削,不能顯影,但在Z-scan曲線上相應(yīng)區(qū)域仍有波型,術(shù)后上皮厚度應(yīng)是表皮波峰與相應(yīng)神經(jīng)叢波峰之間的距離;LASIK術(shù)后角膜組織反應(yīng)使得部分角膜基質(zhì)細胞在Z-scan曲線的光強度值有所改變,細胞反光增強,被認為有“激活”。在掃描曲線出現(xiàn)了相應(yīng)的高波,波長即是基質(zhì)激活區(qū)域的深度。以上所采集數(shù)據(jù),均以測量 3次取平均值作為統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

Figure 1 Z-scan curve Z-scan曲線

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 視力 術(shù)后第 1天、第3天、第7天、第 10天、第 30天、第 60天、第 90天視力分別為1.34±0.66、1.24±0.76、1.27±0.73、1.26±0.76、1.08±0.80、0.96±0.76、0.80±0.72。術(shù)后第90天,低度、中度近視組與高度近視組視力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P＜0.05)。

2.2 屈光狀態(tài)變化 LASIK術(shù)后第1天、第3天、第 7天、第 10天、第 30天、第 60天、第 90天屈光狀態(tài)平均偏移分別為(1.07±0.63)D、(0.97±0.63) D、(0.79±0.63)D、(0.74±0.64)D、(0.37±0.34) D、(0.50±0.33)D、(0.47±0.52)D,屈光狀態(tài)逐漸由遠視狀態(tài)向正視或近視漂移,這種變化在高度近視眼體現(xiàn)更為明顯。

2.3 角膜上皮厚度變化 與術(shù)前相比,48例(48眼)LASIK術(shù)后角膜上皮厚度平均增加10.7%。角膜上皮厚度從術(shù)后第 1天開始增長,第 7-10天最為明顯。術(shù)后第 90天,平均角膜上皮厚度高于術(shù)前(49.16±8.92)μm。低中度近視組與高度近視組患眼在術(shù)后各時間點角膜上皮厚度比較差異均無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(均為P＞0.05,見表1),但高度近視組患眼上皮厚度增長幅度較大(14.00%)。

CM下,LASIK術(shù)后角膜上皮細胞形態(tài)發(fā)生變化,厚度增加。術(shù)后第 1天,角膜上皮形態(tài)改變,出現(xiàn)多角形表層上皮,光反射度高于正常細胞(圖 2)。術(shù)后第3天,上皮出現(xiàn)“層化”現(xiàn)象(圖 3),細胞核消失,細胞變大,排列紊亂,反光強度增強,基底膜水腫,基底細胞邊界明顯隆起,形成嵴狀(圖 4)。術(shù)后第10天,上皮細胞反射異常增高,但排列較為整齊(圖5)。術(shù)后第 30天,上皮細胞排列整齊,光反射正常,但下方稀疏,細胞部分缺失上皮(圖 6)。術(shù)后第60天、第 90天上皮細胞形態(tài)接近正常(圖7)。

2.4 角膜上皮厚度變化的相關(guān)性 CM下,LASIK術(shù)后基質(zhì)形態(tài)學(xué)發(fā)生改變。術(shù)后第 1天,手術(shù)界面以下基質(zhì)中角膜細胞高反射,呈卵圓形,與正常角膜細胞的多角形明顯有異,稱之為“激活細胞”(圖8)。術(shù)后第 3天,激活細胞變?yōu)樗笮?并產(chǎn)生高反射的細胞外基質(zhì)(圖9)。高度近視組患者的基質(zhì)激活細胞平均深度為(65.51±11.48)μm,低中度近視組為(47.72±13.55)μm,2組之間差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(t=-4.499,P=0.000)。

表 1 低中度近視組、高度近視組患眼術(shù)后不同時間角膜上皮角膜厚度的變化Tab le 1 Changes of thickness of corneal epithelium in low-m edium m yopia group and high m yopia group at different time points (l/μm)

Figure 2 One day after surgery,epithelial cell changed and immature polygonal surface epithelial appeared.Figu re 3 Three days after surgery,the epithelial cells showed high reflection and abnormalmorphology.Figure 4 Three days after surgery,the basementmembrane arised odema,and cell bordersshowed obviousapophysis,forming ridge.Figure 5 Ten daysafter surgery,the reflection ofepithelialcells abonormally increased,but epithelial cellsarranged neatly.Figu re 6 Thirty daysafter surgery,epithelial cellsarranged in order,reflectivity wasnormal,but the normal cells partly loss. Figure 7 Sixty and ninty days after surgery,corneal epithelium showed normal 圖2 術(shù)后第1天,角膜上皮形態(tài)改變,出現(xiàn)多角形的不成熟表層上皮。圖 3 術(shù)后第3天,角膜上皮細胞高反射,細胞形態(tài)異常。圖 4 術(shù)后第 3天,基底膜水腫,細胞邊界明顯隆起,成嵴狀。圖 5 術(shù)后第 10天,角膜上皮細胞反射異常增高,但排列較為整齊。圖6 術(shù)后第 30天,角膜上皮細胞排列整齊,光反射正常,但下方稀疏,細胞部分缺失。圖 7 術(shù)后第60天、第 90天,角膜上皮形態(tài)接近正常

Figure 8 One day after surgery,the oval,larger heratocyte with a higher reflectivitywere known as“activated-cell”.Figure 9 Three daysafter surgery,stroma cell below the“interface”became spindle and produced slightly higher reflective extracellularmatrix 圖8 術(shù)后第1天,基質(zhì)中角膜細胞高反射,呈卵圓形,稱之為“激活細胞”。圖 9 術(shù)后第 3天,“界面”以下基質(zhì)中角膜細胞變長為梭形,并產(chǎn)生反射稍高的細胞外基質(zhì)

LASIK術(shù)后,平均角膜上皮厚度變化與術(shù)前等效球鏡值、角膜前表面曲率變化呈正相關(guān) (r1= 0.538,P1=0.047;r2=0.648,P2=0.007)。角膜上皮厚度變化與基質(zhì)厚度、角膜瓣厚度、基質(zhì)細胞激活深度無相關(guān)性(r1=0.238,P1=0.647;r2=0.197, P2=0.841;r3=0.214,P3=0.714)。

3 討論

角膜創(chuàng)傷修復(fù)是一個復(fù)雜的過程,通常包括角膜細胞的激活、增殖、分化及細胞因子的釋放、細胞外基質(zhì)的合成與重構(gòu)等,是眾多細胞因子和多種細胞在時間和空間上高度協(xié)調(diào)而完成的。創(chuàng)傷修復(fù)反應(yīng)的差異性已成為影響各種屈光性角膜手術(shù)穩(wěn)定性和預(yù)測性的重要因素[3]。近年來,人們通過兔、鼠等大量動物實驗來探求LASIK術(shù)后的創(chuàng)傷修復(fù)過程,但兔眼角膜缺乏前彈力層,與人眼角膜結(jié)構(gòu)存在明顯種屬差異,其結(jié)果不能完全替代人眼角膜的愈合狀態(tài)。CM的應(yīng)用為活體客觀研究屈光手術(shù)后的角膜變化提供了良好的工具。

彌補性上皮增殖被認為是準分子激光角膜切削術(shù)(photorefractive keratectomy,PRK)后屈光回退的機制[4]。有報道表明:PRK術(shù)后近視漂移與上皮增殖有一定的關(guān)系,且上皮厚度每增長 18μm,會產(chǎn)生1.00 D的近視[5]。Esquenazi等[6]和Gauthier等[7]報道猴與人在PRK術(shù)后角膜上皮有過度增殖的現(xiàn)象。Assil等[8]在角膜放置基質(zhì)環(huán)眼和其他屈光手術(shù)眼中亦發(fā)現(xiàn)相同的上皮增殖現(xiàn)象。傳統(tǒng)認為,上皮細胞增殖一般多見于基質(zhì)損傷的角膜病患眼,為了保持角膜表面的光滑,上皮細胞通過增殖來充填基質(zhì)缺損,恢復(fù)角膜表面原有的曲率。本研究對LASIK術(shù)后角膜中央上皮的測量證實了上皮在角膜受到創(chuàng)傷后發(fā)生增殖的現(xiàn)象。CM下觀察到術(shù)后角膜上皮形態(tài)發(fā)生改變,厚度增加,表現(xiàn)為細胞輪廓變大,排列紊亂,反光強度增高?；啄ぜ毎吔巛^術(shù)前隆起,邊緣銳利,反光增強。這種變化在深度切削眼中尤為明顯。CM下角膜上皮在角膜受到創(chuàng)傷后出現(xiàn)“層化”和增厚現(xiàn)象,證實了上皮在角膜切削后的變化。我國學(xué)者對術(shù)后各時間點角膜全厚、角膜基質(zhì)厚度、角膜瓣基質(zhì)厚度、基質(zhì)床厚度的研究表明,角膜各層厚度的增長其差異性沒有統(tǒng)計學(xué)意義[9],所以不足以用基質(zhì)增厚來解釋組織修復(fù)。本研究結(jié)果表明,術(shù)后早期角膜上皮參與了LASIK術(shù)后早期角膜組織修復(fù)的過程,上皮厚度增加。隨著術(shù)后角膜修復(fù)時間的延長,上皮細胞排列趨于整齊,形態(tài)接近正常,反射強度由高逐漸降低。隨之,角膜趨于安靜狀態(tài),屈光狀態(tài)趨于穩(wěn)定。這一觀點對術(shù)后早期用藥有一定的指導(dǎo)意義。

在角膜基質(zhì)界面上、下出現(xiàn)了大量的“激活細胞”,其細胞核伸長為梭形,不規(guī)則排列,具有細胞核多突起、反光強度高等特點,被認為是基質(zhì)細胞受刺激后轉(zhuǎn)化為成纖維細胞,分泌細胞外基質(zhì)以修復(fù)創(chuàng)傷。本研究進一步觀察到高度近視眼的基質(zhì)激活細胞深度與低中度近視眼之間存在明顯差異。換言之,激光切削基質(zhì)量越大,基質(zhì)激活細胞的數(shù)量就越多[10]。Taliana等[11]認為當上皮和基質(zhì)受到創(chuàng)傷時,上皮細胞和角膜基質(zhì)細胞均直接參與修復(fù)過程,基質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為纖維母細胞,而基質(zhì)細胞與纖維母細胞比值的大小直接影響到上皮的改變,上皮的這種改變不同于上皮細胞正常新陳代謝時的分化,它可以促使上皮細胞排列,更符合角膜的生理要求。LASIK術(shù)后的上皮重塑原因不明。Reinstein等[12]推測,LASIK術(shù)后角膜上皮厚度的變化是由于角膜上皮具有彌補其下方基質(zhì)不正常而導(dǎo)致角膜曲率改變的能力,是一種自我修飾和自我修復(fù)的表現(xiàn)。上皮厚度的變化與角膜表面的形態(tài)改變關(guān)系更加緊密。

LASIK術(shù)中角膜瓣過薄或過厚都會對LASIK手術(shù)產(chǎn)生一定的影響。本結(jié)果表明,角膜上皮的變化與角膜瓣的厚度沒有相關(guān)性,這一觀點已得到眾多理論證實。Wachtlin等[13]發(fā)現(xiàn)LASIK術(shù)后除角膜瓣邊緣可見細胞纖連蛋白和tenascin反應(yīng)呈陽性外,層間呈無細胞區(qū),愈合反應(yīng)輕。Maguen等[14]利用免疫組織化學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)LASIK術(shù)后層間金屬蛋白酶-1、金屬蛋白酶-2水平升高,上皮基底膜內(nèi)的Ⅳ型膠原異構(gòu)體減少。這些研究都反映了LASIK術(shù)后角膜層間愈合反應(yīng)輕,角膜瓣與瓣下基質(zhì)床之間不能形成瘢痕組織,二者貼合不夠緊密。這種特殊的愈合方式雖然保留了清晰的視覺光區(qū),但在功能上存在異常,抵抗外力弱,對維持角膜的機械抵抗力無直接作用,這些研究結(jié)果證實了角膜瓣的薄厚沒有引發(fā)角膜上皮的重塑[15]。

綜上所述,術(shù)后早期角膜上皮厚度增加,上皮參與了LASIK術(shù)后早期角膜組織修復(fù)的過程,LASIK術(shù)后屈光狀態(tài)變化與上皮厚度的增減有關(guān)。適度抑制LASIK術(shù)后角膜上皮細胞的增殖,從而控制角膜上皮的過度增生,這一結(jié)果可能對術(shù)后屈光狀態(tài)回退明顯的高度近視患者具有重要的臨床意義。

1 Chayet AS,Assil KK,Mon tes M,Esp inosa-Lagana M,Castellanos A,Tsioulias G,et al.Regression and its mechanisms after laser in situ keratom ileusis in moderate and high myopia[J].Ophthalm ology,1998,105(7):1194-1199.

2 喬麗萍,孫慧敏,趙少貞,袁佳琴.近視眼中央角膜的共聚焦顯微鏡觀察[J].中華眼科雜志,2006,42(1):54-56.

3 Gauth ier CA,Epstein D,Holden BA,Tengroth B,Fagerholm P, Hamberg-Nystr?m H,et al.Epithelial alterations fo llow ing photorefractive keratectomy for myopia[J].JRefract Su rg,1995,11 (2):113-118.

4 SundarRaj N,Geiss MJ 3rd,Fantes F,Hanna K,Anderson SC, Thom pson KP,et a l.Healing o f excimer laser ablated m onkey corneas.An imm unohistochem icalevaluation[J].Arch Ophthalm ol,1990,108(11):1604-1610.

5 Moller-Pedersen T,Cavanagh HD,Petro llWM,Jester JV.Strom al w ound healing explains refractive instab ility and haze developm ent after photo refractive keratectomy:A 1-year con focal m icroscopic study[J].Oph tha lm ology,2000,107(7):1235-1245.

6 Esquenazi S,He J,Bazan NG,Bazan HE.Comparison of co rneal wound-healing response in pho torefractive keratectomy and laser-assisted subepithelial keratectomy[J].J Cataract Refra ct Surg,2005,31(8):1632-1639.

7 Gauthier CA,Holden BA,Ep stein D,Tengroth B,Fagerholm P, Hamberg-Nystr?m H.Facto rs affecting epithelial hyperplasia after photorefractive keratectomy[J].J Ca taract Refra ct Surg, 1997,23(7):1042-1050.

8 Assil KK,Quantock AJ,Barrett AM,Schanzlin DJ.Corneal iron lines associated w ith the intrastrom al corneal ring[J].Am J Ophtha lmol,1993,116(3):350-256.

9 喬麗萍,孫慧敏,趙少貞,袁佳琴.LASIK術(shù)后早期角膜基質(zhì)細胞改變的臨床研究[J].眼視光學(xué)雜志,2006,8(3):137-140.

10趙少貞,喬麗萍,孫慧敏,袁佳琴.LASIK術(shù)后角膜基質(zhì)形態(tài)改變的臨床研究[J].眼科研究,2006,24(3):244-247.

11 Taliana L,Evans MD,Dim itrijevich SD,Steele JG.The influence o f stromal contraction in a wound m odel system on corneal ep ithelial stratification[J].Invest Oph thalm ol Vis Sci,2001,42 (1):81-89.

12 Reinstein DZ,Silverm an RH,Sutton HF,Co leman DJ.Very h ighfrequency ultrasound co rnealanalysis iden tifies anatom ic correlates of optical complication o f lamellar refractive surgery.Anatom ic d iagnosis in lam ellar surgery[J].Ophthalm ology,1999, 106(3):474-482.

13 Wach tlin J,Langenbeck K,Schrǜnder S,Zhang EP,Hoffmann F. Imm unohistology of co rneal w ound healing after photorefractive keratectom y and laser in situ keratom ileusis[J].J Refra ct Surg,1999,15(4):451-458.

14 Maguen E,Zorapapel NC,Zieske JD,Ninom iya Y,Sado Y,Kenney MC,et a l.Extracellularm atrix and m atrix metallopro teinase changes in hum an corneas after com plicated laser-assisted in situ keratomileusis(LASIK)[J].Cornea,2002,21(1):95-100.

15張立軍,張 巖,王佼佼,蔣 華.SBK與LASIK治療高度近視眼患者的臨床對比研究[J].眼科新進展,2010,30(6):547-550.