黃玉蘭，岳才軍，張福振

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶163319）

木瓜別名皺皮木瓜、宣木瓜，為我國特有的野生果木之一。木瓜為薔薇科木瓜屬植物，用途廣泛，集觀賞、食用、藥用于一體[1]。傳統(tǒng)中醫(yī)認為木瓜有舒筋活絡(luò)、健脾開胃、舒肝止痛的功效[2，3]?，F(xiàn)代研究表明，木瓜富含多種氨基酸及營養(yǎng)元素，并含有齊墩果酸、黃酮、SOD等活性物質(zhì)，其中齊墩果酸（Oleanolic acid，簡稱OA）為木瓜的主要藥效成分，具有消炎抑菌、降低轉(zhuǎn)氨酶，促進肝細胞再生、防止肝硬化、降血脂、降血糖、提高機體免疫功能等作用，是當前治療肝炎的有效藥物之一[4]。

木瓜中齊墩果酸可由種子或果實中提取，多采用有機酸、醇、堿等方法，但存在提取率低、資源浪費、污染嚴重的弊端。研究表明，在培養(yǎng)的植物細胞、組織中，大部分次生代謝產(chǎn)物的含量超過了野生植物的含量，這也是植物細胞工程在中藥現(xiàn)代化過程中具有巨大發(fā)展前景的重要原因之一[5]。本試驗從木瓜芽孢中誘導(dǎo)出木瓜愈傷組織，并確立了愈傷組織中齊墩果酸的比色測定方法，為木瓜細胞的懸浮培養(yǎng)及齊墩果酸的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗材料為超市購買的木瓜，木瓜籽先用自來水、再用蒸餾水沖洗干凈后待用；齊墩果酸標準品，批號為110709-200304，中國藥品生物制品檢定所；香草醛、高氯酸、冰醋酸、蔗糖等，均為分析純；NAA（萘乙酸），2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸），6-BA（6-芐氨基嘌呤）為常規(guī)生化試劑。

1.2 愈傷組織誘導(dǎo)

用40mg·L-1的赤霉素處理24 h，再用質(zhì)量濃度為1 g·L-1的HgCL2將木瓜種子表面消毒8～10min，用滅菌水沖洗3～4次用于接種到MS培養(yǎng)基上，長出芽孢狀后，再將芽孢切成0.2 cm×0.3 cm的小塊，接種在MS附加2，4-D、6-BA、NAA的不同激素組合的固體培養(yǎng)基中，其中蔗糖30 g·L-1，瓊脂7 g·L-1，pH5.8～6.0，培養(yǎng)基分裝于100mL的三角燒瓶中，每瓶40mL，溫度（25±1）℃，進行暗培養(yǎng)，測其愈傷組織誘導(dǎo)情況。

1.3 愈傷組織中齊墩果酸含量的測定

1.3.1 齊墩果酸的提取

取適量木瓜愈傷組織培養(yǎng)細胞烘干，粉碎，分成3份，每份1.000 g，精密秤定，加20 mL 95%乙醇浸泡10 h，然后將泡好材料裝入自制的滲漉筒（針管）中，開始滲漉，控制流速（3～5滴·min-1），至濾液幾乎無色。再用水浴鍋對滲漉液進行干燥，得干浸膏，并加入0.5mL 95%乙醇溶解，并定容，待測定用。

1.3.2 齊墩果酸含量的測定方法

1.3.2.1 齊墩果酸標準品的配制

以齊墩果酸為標準品，精密稱取干燥至恒重的齊墩果酸標準品0.003 7 g，以甲醇溶解，定容至10mL。

1.3.2.2 齊墩果酸標準曲線的制備

精密吸取齊墩果酸標準品10、50、100、200、250μL，分別置于10mL具塞試管中，水浴揮干溶劑加入新配制的5%香草醛冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8mL，于60℃水浴中保溫15min，立即置于冰水中冷卻5 min，加冰醋酸5 mL，搖勻后放置10 min，以空白試劑作參比，在547 nm波長處立即測量吸光度。以蒸餾水做空白對照，得齊墩果酸標準曲線[6]。

1.3.2.3 齊墩果酸的含量測定

分別取樣品液20μL，標準液20μL，分別點于同一硅膠G板上，以氯仿-丙酮（4∶1）為展開劑展開，待展開至硅膠板上端邊緣還有1厘米處取出，揮去溶劑，噴以5%磷鉬酸，于105℃烘5 min，刮取與對照品相同位置上的藍色斑點，置具塞試管中[7]。先精密加入新制的5%香草醛冰醋酸液0.2 mL及高氯酸0.8mL，在70℃恒溫水浴加熱15min，流水冷卻至室溫，再精密加入乙酸乙酯4 mL，搖勻，離心取上清液在547 nm處測定，并根據(jù)標準曲線換算出樣品齊墩果酸的含量[8]。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同植物激素對誘導(dǎo)愈傷組織的影響

不同激素種類、濃度誘導(dǎo)木瓜芽孢形成愈傷組織的能力，結(jié)果見表1。

表1 NAA、2，4-D和6-BA的組合對木瓜芽孢愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 1 The effectof NAA，2，4-D，and 6-BA combination on Chaenomeles lagenaria spore callus

從表1看出：2，4-D對誘導(dǎo)芽孢愈傷組織具有很好的效果，誘導(dǎo)率也很高，附加的NAA對愈傷組織產(chǎn)生無明顯促進作用，這與文獻報道相符[8]。誘導(dǎo)愈傷組織的最適培養(yǎng)基為MS+2，4-D2.5 mg·L-1+6-BA0.5mg·L-1。在最適培養(yǎng)基中，接種15 d后開始有黃綠色和淡黃色絮狀愈傷組織出現(xiàn)在切面表面，初期愈傷組織生長緩慢，芽胞內(nèi)部組織未愈傷化。40 d左右，將愈傷組織及內(nèi)部切成小塊進行繼代培養(yǎng)，以后每30 d繼代1次，當繼代2次后，其內(nèi)部組織全部愈傷化，愈傷組織生長量大，大多為淡黃色，致密和疏松兼有，顆粒狀?？梢娔竟涎堪挠鷤M織先從表面發(fā)生，以后逐漸向內(nèi)生長，這與張美萍等（1999）報道的相似[9]。

2.2 齊墩果酸的含量測定

2.2.1 標準曲線的制備

以吸光度（A）對標準品量（C）作圖，用最小二乘法得其線性回歸方程為A=0.004 5x+0.013，相關(guān)系數(shù)r=0.999 3，表明齊墩果酸在3.70～92.50μg·mL-1范圍內(nèi)很好地符合朗伯-比爾定律。

2.2.2 分離結(jié)果及含量測定結(jié)果

由層析結(jié)果看出各種培養(yǎng)基上的愈傷組織提取液都有與標準品對應(yīng)的層析點（圖1）。紫外掃描分析得出與標準品完全相同的吸收光譜，證明提取物為齊墩果酸。然后用分光光度法進行定量測定，結(jié)果見表2。

圖1 齊墩果酸樣品分離圖譜Fig.1 Oleanolic acid separationmap

根據(jù)齊墩果酸的標準曲線換算出樣品齊墩果酸 的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品中齊墩果酸的含量測定結(jié)果Table 2 Content determination of oleanolic acid

從表2可以看出所測木瓜愈傷組織中齊墩果酸含量比較可觀，達0.078%，高于姚秀玲等（2005）測定的鮮木瓜中齊墩果酸含量[10]。

3 結(jié)論

在木瓜愈傷組織繼代培養(yǎng)過程中，愈傷組織在激素組合MS+2，4-D2.5 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1的MS培養(yǎng)基中生長速度快，狀態(tài)良好。采用薄層色譜-分光光度法測定木瓜愈傷組織中齊墩果酸的含量，方法簡便、可靠，實際可行，為木瓜細胞的懸浮培養(yǎng)及齊墩果酸的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

［1］黃鎖義，劉?；?，黎海妮，等.超聲波提取木瓜葉總黃酮及其鑒別［J］.時珍國醫(yī)國藥，2006，17（10）：167-168.

［2］吳虹，魏偉，吳成義.木瓜化學(xué)成分及藥理活性的研究［J］.安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2004，23（2）：62-64.

［3］孫連娜，洪永福.簡述中藥木瓜的化學(xué)、藥理與臨床應(yīng)用研究［J］.藥學(xué)實踐雜志，1999，17（5）：281-283.

［4］王丹丹，葛文中.齊墩果酸衍生物合成及抗腫瘤活性的研究［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2010，22（3）84-88.

［5］唐春紅，項昭保，葉志義，石軼松，等.木瓜中齊墩果酸的提取工藝研究［J］.食品工業(yè)科技，2000，21（4）：10-12.

［6］阮洪生，陳志寶，朱丹，等.豆粕中大豆皂苷提取工藝的研究［J］.糧食與食品工業(yè)，2008，1（15）：15-17.

［7］陳明珠.齊墩果酸片的比色測定［J］.中草藥，1981，12（9）13-14.

［8］張治國，韓獻忠，蔡志光，等.條葉龍膽愈傷組織培養(yǎng)及龍膽苦甙形成［J］.植物學(xué)報，1992，34（2）：96-100.

［9］張美萍，王義，羅維瑩，等.西洋參愈傷組織培養(yǎng)及皂甙含量分析［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報1999，21（1）：46-48.

［10］姚秀玲，呂曉玲，李肇獎.木瓜中齊墩果酸的測定方法研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2005，21（3）126-128.