侯美如，侯喜林，高俊峰，劉振格，王杰，楊明發(fā)

（黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，大慶163319）

牛輪狀病毒是引起犢牛腹瀉的重要病原之一[1]。本病主要感染1～7日齡的犢牛，可引起犢牛消化道機能紊亂，臨床上以嘔吐、腹瀉、脫水和酸堿平衡紊亂為特征。感染牛常發(fā)生死亡，病死率可達50%。

目前檢疫、診斷BRV常用的方法為中和試驗、病毒分離、瓊擴試驗、RT-PCR等。但這些方法都存在著檢測時間長或敏感性低等缺點，尤其對處于免疫耐受和持續(xù)性感染的牛容易出現(xiàn)漏檢。研究以實驗室分離并保存的BRV-DQ株建立了雙抗體夾心ELISA檢測方法，旨在為牛輪狀病毒的快速診斷和病原學調查提供一種更好的方法。

1 材料與方法

1.1 細胞、毒株與實驗動物

MA104細胞黑龍江八一農(nóng)墾大學傳染病實驗室保存。牛輪狀病毒（BRV-DQ株），牛呼吸道合胞體病毒（BRSV）、牛冠狀病毒（BCV）和牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）均由黑龍江八一農(nóng)墾大學傳染病實驗室分離保存；待檢40份牛腹瀉樣品收集于大慶某牧場；2.0-2.5 kg的健康雄性家兔，購買于當?shù)仞B(yǎng)殖戶；體重18-22 g昆明小鼠，購買于長春生物制品研究所。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、新生牛血清、胰蛋白酶（1∶250）均購自GIBCO公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑和HRP標記的羊抗鼠抗體購自 Sigma公司；Q sepharoseTMFast Flow購自HiPrep公司。

TrizolReagent購自Invitrogen公司；M-MuLV反轉錄酶（200U·μL-1）、HPR IRNA酶抑制劑（40U·μL-1）、dNTP（10mmoL·L-1）、LA Taq DNA聚合酶（5 U·μL-1）、dNTPs（2.5 mmoL·L-1）、DNA Marker DL2 000均購自TaKaRa公司；DEPC水、瓊脂糖均購自Sigma公司；引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3 病毒的培養(yǎng)及純化

將輪狀病毒與終濃度為20μg·mL-1的胰蛋白酶37℃作用1 h，接種于已長成單層處于對數(shù)生長期的MA104細胞，0.5 mL·瓶-1，37 ℃吸附 1 h，間隔15min輕搖1次，使濾液與細胞充分接觸。吸附后倒凈殘液，加入4.5 mL含5μg·mL-1胰酶的維持液（不含血清），于37℃5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。當出現(xiàn)80%細胞病變（CPE）時收毒，-80℃反復凍融3次后，12 000 r·min-14℃離心1 h，40 000 rpm 4℃離心240min，棄上清，收集病毒，用PBS重新懸浮病毒，用基因定量儀測定其濃度。然后將其分裝保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 鼠、兔抗BRV IgG的制備與純化

1.4.1 鼠抗BRV超免疫血清的制備

以純化的BRV加弗氏完全佐劑背部皮下多點注射首免小鼠，100μg·只-1；間隔7 d用滅活的BRV加弗氏不完全佐劑加強免疫，100μg·只-1，連續(xù)2次，每次間隔7 d，最后1次免疫后7 d當血清瓊擴效價達1∶16以上時，即采血分離血清。

1.4.2 兔抗BRV超免疫血清的制備

以純化的BRV加弗氏完全佐劑兔兩側掌（拓）內皮下注射首免家兔，200μg·只-1；第15 d用BRV加弗氏不完全佐劑皮下多點注射加強免疫，500μg·只-1；第30 d肌肉注射混有雙抗的牛IgG抗原200μg，三免1周后，當血清瓊擴效價達1∶16以上時，即采血分離血清。

1.4.3 兔、鼠抗BRV IgG的純化

用飽和硫酸銨沉淀法[3]粗提兔、鼠抗BRV IgG，再以陰離子交換層析（Q sepharoseTMFast Flow）純化[3，4]，用ELISA檢測活性蛋白，收集含量最多的活性蛋白峰。并用SDS-PAGE測定其純度，基因定量儀測定其濃度。

1.5 間接夾心ELISA方法的建立

1.5.1 操作程序

按文獻[3]進行操作。

1.5.2 最佳反應條件的選擇

在不同的反應條件下，對兔抗BRV IgG包被量（20、10、5、2.5μg·mL-1），鼠抗BRV IgG工作濃度（20、10、5、2.5、1.25μg·mL-1），HRP標記的羊抗鼠IgG稀釋度（1∶2 500、1∶5 000、1∶10 000），封閉液的選擇（1%明膠、5%脫脂乳、1%BSA、10%胎牛血清），封閉時間（37℃反應30、60、90、120 min）進行ELISA方陣試驗，檢測同一陽性樣品和陰性樣品，測定OD450nm值，并計算P/N值，確定兔抗BRV IgG最佳包被濃度、鼠抗BRV IgG最佳濃度、最佳封閉液、封閉時間及酶標抗體工作濃度。

1.5.3 ELISA判定標準

用建立的ELISA方法測定30份BRV陰性樣品，計算OD450nm平均值和標準差，陽性臨界值=陰性OD450nm平均值+3×標準差，當樣品OD450nm值大于陽性臨界值時即判為陽性，小于此值則判為陰性。

1.6 重復性試驗

1.6.1 板內重復性試驗

在同一塊酶標板內檢測5份不同抗原水平的樣品，每份樣品重復4孔，按最佳條件進行ELISA。計算同一份樣品OD450nm值的變異系數(shù)（CV），以檢驗板內檢測樣品的重復性。

1.6.2 板間重復性試驗

取4塊酶標板，以同一批制備的抗體包被，在相同條件下5份不同抗原水平的樣品，按最佳條件進行ELISA，計算同一份樣品在不同板間OD450nm值的變異系數(shù)（CV），以檢驗板間檢測樣品的重復性。

1.7 特異性試驗

將本實驗室保存的牛呼吸道合胞體病毒（BRSV）、牛冠狀病毒（BCV）和牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）進行稀釋，同時設BRV標準陰、陽性作為對照，每種樣品做2個重復，按照雙抗體夾心ELISA方法進行檢測，以評價該方法的特異性。

1.8 靈敏性試驗

將純化的BRV細胞毒測定含量后，按1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶2 560、1∶5 120倍比稀釋，各取100μL進行ELISA檢測，計算最低病毒檢出量。

1.9 以RT-PCR試驗為參照評估本ELISA檢測方法

40份牛糞便樣品采自大慶地區(qū)養(yǎng)殖場，糞便用pH7.0的PBS稀釋成200mg·mL-1懸液，微型旋渦振蕩2 min，3 000 r·min-1冷凍離心10 min，取上清液，利用本試驗建立的ELISA檢測方法與RT-PCR[5]同時檢測，并將這2種方法的檢測結果進行比較，確定本方法的特異性、敏感性和符合率。RT-PCR檢測的陰性樣品用ELISA檢測為陰性的檢出率即為特異性；RT-PCR檢測的陽性樣品用ELISA檢測為陽性的檢出率即為敏感性；兩種方法檢測結果一致的血清樣本總數(shù)占總體樣本的比例即為兩者的符合率[6]。

2 結果

2.1 病毒的純化

牛輪狀病毒經(jīng)差速離心（12 000 r·min-14℃離心60 min，40 000 rpm 4℃離心240min）純化，測定的含量為3.60mg·mL-1。

2.2 鼠、兔抗BRV IgG的純化

鼠、抗BRV超免疫血清經(jīng)陰離子交換層析后，共收集到4個蛋白峰，經(jīng)檢測，第2～4峰為活性峰，收集產(chǎn)量最大的第3峰蛋白用于ELISA，測定其含量為2.44mg·mL-1。兔抗BRV超免疫血清經(jīng)陰離子交換層析后共收集到4個蛋白峰，經(jīng)檢測，第2～4峰為活性峰，收集產(chǎn)量最大的第2峰蛋白用于ELISA，測定其含量為2.56mg·mL-1。

2.3 雙抗體夾心ELISA方法的建立

2.3.1 最佳反應條件的確定

通過ELISA方陣試驗確定了主要的工作條件：兔抗BRV IgG最佳包被濃度為10μg·mL-1；鼠抗BRV IgG最佳濃度為5μg·mL-1；酶標羊抗鼠IgG最佳工作濃度為1∶5 000；最佳封閉液為5%脫脂乳；最佳封閉時間為1 h。結果見表1。

表1 兔抗BRV IgG和鼠抗BRV IgG最適工作濃度的確定Table 1 Determination of the optimal concentration of coating antibody and mouse-anti-BRV-IgG

2.3.2 ELISA判定標準

用雙抗體夾心ELISA檢測30份陰性樣品的OD450nm值，根據(jù)公式計算陽性臨界值=陰性OD450nm平均值+3×標準差=0.225 5+0.068 8×3=0.432。因此，以OD450nm值=0.432作為ELISA結果判定的臨界值。在陰性和陽性對照成立的情況下，確定OD450nm值≥0.432時，則判為 BRV抗體陽性；OD450nm值＜0.432時，則判為BRV抗體陰性。

2.4 重復性試驗

用建立的ELISA檢測5份不同抗原水平的樣品，每份樣品重復4次，重復性分析結果可見其板內變異系數(shù)在3.64%～5.87%之間，板間變異系數(shù)在4.60%～8.75%之間，板間、板內變異系數(shù)勻小于10%，說明此方法具有較好的重復性。

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2.5 特異性試驗

建立的雙抗體夾心ELISA只與BRV陽性樣品反應，與其他3種牛病的陽性樣品的OD450nm值均小于0.432，無交叉反應性，表明本試驗所建立的雙抗體夾心ELISA方法有較好的特異性。

2.6 靈敏性試驗

隨著病毒含量的降低，其OD450nm值呈線性下降，當純化病毒1∶2 560稀釋（病毒含量為1.41μg·mL-1）時，結果為陽性（OD450nm值為0.491），而稀釋度為1∶5 120時，結果為陰性（OD450nm值為0.403），則該方法可檢測的最低病毒濃度為1.41μg·mL-1，具有較高的敏感性。

2.7 以RT-PCR試驗為參照評估本ELISA檢測方法

利用本試驗建立的雙抗體夾心ELISA檢測方法與RT-PCR試驗同時檢測40份牛糞便樣品，檢測結果見表 2，利用制備的兔抗 BRV IgG和鼠抗BRV IgG蛋白建立的雙抗體夾心ELISA與RT-PCR試驗的符合率達95%。

表2 雙抗體夾心ELISA方法與RT-PCR試驗的比較結果Table 2 Comparison between Sandwich ELISA and RT-PCR test for detecting field samples

3 討論

建立雙抗體夾心ELISA方法檢測牛輪狀病毒，其中使用的兔、鼠抗BRV IgG純度是試驗成功的關鍵，其純度越高（非特異性抗體和雜蛋白越低），非特異性反應越低。本試驗通過硫酸銨沉淀后用陰離子交換層析的方法，對自制的兔、鼠抗BRV IgG進行純化，以達到降低非特異性反應的目的。

離子交換層析與硫酸銨沉淀法聯(lián)合使用可以有效地純化抗體。初步分離純化時，采用飽和硫酸銨（SAS），依次以50%、40%、33%飽和度的硫酸銨溶液純化一次，即可得到較純的抗體粗制品[7]。本試驗根據(jù)lgG的特性，和其等電點為5.5～8.3的性質，選用Q sepharoseTMFast Flow陰離子交換柱對其進行純化。Q sepharoseTMFast Flow陰離子交換柱是目前國際上趨向于使用的一種強離子交換劑，其具有流速高，交換容量大等特點，適用于IgG的純化。使用Q sepharoseTMFast Flow陰離子交換柱在pH8.5條件下對鼠、兔抗BRV IgG粗提產(chǎn)物進行純化，能夠將目的蛋白分離出來。較高pH值的Buffer A對免疫球蛋白的活性并沒有產(chǎn)生影響。并以牛輪狀病毒為包被抗原建立間接ELISA方法，測定不同蛋白峰活性，結果表明同時有多個蛋白峰都具有免疫活性，取不同活性峰蛋白以SDS-PAGE來鑒定其純度，并篩選試驗使用所需的蛋白峰。該方法可獲得濃度大、純度高的目的蛋白。

試驗通過方陣滴定試驗對雙抗體濃度和酶標羊抗鼠IgG濃度條件進行篩選，確定鼠抗BRV IgG、兔抗BRV IgG和酶標羊抗鼠IgG稀釋度為5μg·mL-1、10μg·mL-1、1∶5 000時，效果最好。并對最佳封閉液，最佳封閉時間，最佳二抗工作濃度進行優(yōu)化試驗，盡最大可能低了非特異性反應的發(fā)生，從而提高了其敏感性。試驗證明只在檢測牛輪狀病毒陽性抗原時，ELISA反應呈陽性，而與牛呼吸道合胞體病毒（BRSV）、牛冠狀病毒（BCV）和牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）抗原呈陰性反應，說明所建立的雙抗體夾心ELISA方法具有特異性。

本試驗建立的雙抗體夾心ELISA，可應用于快速檢測牛輪狀病毒抗原，其敏感性較高，最低能檢測到含量為1.41μg·mL-1的輪狀病毒抗原。并與其中檢測抗原的RT-PCR方法進行比較，符合率為95%。由此可見，雙抗體夾心ELISA方法與RT-PCR的檢測結果具有較高的符合率。

在細胞培養(yǎng)物和糞便樣品標本中均存在三種形式的病毒粒子，即具有雙層衣殼的完整病毒粒子（由VP1，2，3，4，6，7組成），具有單層衣殼的病毒粒子（由VP1，2，3，6組成），不成熟的只有空衣殼的病毒顆粒（由VP1，2，3組成）[8]，其中單層衣殼的病毒粒子以VP6蛋白為外衣殼，并且在A群輪狀病毒中，VP6蛋白的基因在序列上具有高度的保守性，且蛋白具有良好的抗原性和免疫原性[9]，從理論上使本試驗建立的雙抗體ELISA可檢測不同血清型的A群輪狀病毒成為可能。

目前，牛輪狀病毒在世界范圍內分布較廣，感染率也較高，對養(yǎng)牛業(yè)危害極大[10]。本研究以純化的兔、鼠抗BRV IgG為原料建立雙抗體夾心ELISA方法，其特異性強、重復性好、省時省力、操作簡便，易于推廣應用，適合大批量地檢測，為BRV檢測試劑盒的研制奠定了基礎。

［1］R de la Fuente，A Garcia，JA Ruiz-Santa-Quiteria，etal.Proportional morbidity rates of enteropathogens among diarrheic dairy calves in central Spain［J］.Preventive Veterinary Medicine，1998，36;145-152.

［2］王重慶.分子免疫學基礎［M］.北京：北京大學出版社，2003.

［3］黃小波，徐璐，曹三杰，等.豬輪狀病毒雙抗體夾心ELISA診斷方法的建立［J］.中國獸醫(yī)科學.2009，39（08）；723-727.

［4］CORTHIER G，BOSCHETTIEJ.Improved method for IgG purification from various animal species by ion exchange chromatography［J］.Immunol Meth，1984，66；75-79.

［5］柳強，侯喜林，車車，等.牛冠狀病毒和輪狀病毒的雙重RT-PCR檢測方法的建立及應用［J］.中國預防獸醫(yī)學報.2009，31（9）；701-704.

［6］王紅，余麗蕓，侯喜林，等.牛呼吸道合胞體病毒重組N蛋白間接ELISA方法的建立及應用［J］.中國農(nóng)業(yè)科學.2010，43（20）；4303-4309.

［7］王延華，抗體理論與技術［M］.北京：科學出版社，2009.

［8］崔曉辰，A群輪狀病毒單克隆抗體及免疫膠體金試紙條制備［D］.黑龍江：東北農(nóng)業(yè)大學，2008.

［9］Kejian Yang，ShixiaWang，Kyeong-Ok Chang etal.Immune responses and protection obtained with rotavirus VP6 DNA vaccines given by intramuscular injection［J］.Vaccine，2001，19；3285-3291.

［10］王潔清，牛輪狀病毒RT-PCR檢測和基于VP6重組抗原檢測血清抗體ELISA方法初步建立［D］.黑龍江：東北農(nóng)業(yè)大學，2009.