劉銅，薛文波，侯巨梅，左豫虎

（黑龍江八一農(nóng)墾大學農(nóng)學院，大慶163319）

由新月彎孢（Curvularia lunata）引起的玉米彎孢葉斑病是我國玉米上發(fā)生普遍的重要葉部病害[1-4]。盡管近年來隨著針對該病原菌的具有熱帶和亞熱帶血緣的抗性品種的選育和推廣應(yīng)用，該病害的危害程度明顯降低，然而人們研究發(fā)現(xiàn)該病原菌致病性變異或生理分化現(xiàn)象非常明顯[5-8]，具有潛在大發(fā)生的可能，因此深入研究該病原菌的致病和生長發(fā)育的調(diào)控分子機制，對于創(chuàng)建持久的防控措施，穩(wěn)定國家玉米生產(chǎn)安全具有重要意義。

目前對該菌致病機理的研究主要集中在細胞壁降解酶、黑色素和毒素等致病因子的鑒定及合成相關(guān)基因的克隆與功能鑒定[9-11]。然而對該菌生長發(fā)育調(diào)控研究鮮有報道。植物病原真菌的生長速度影響其在寄主體內(nèi)的擴展與蔓延，從而在一定程度上影響病害的發(fā)展進程。因此，通過對病原菌生長發(fā)育的分子機理的研究，將可以加深對該病原菌生長發(fā)育調(diào)控的認識，也可能為開發(fā)能夠抑制病原菌發(fā)展的新型制劑提供一些新的靶位點。從而拓寬人們對病原菌防治的視野。本實驗通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法獲得一個生長緩慢的突變體，利用接頭PCR技術(shù)獲得該突變體T-DNA右翼序列，這將為下一步克隆該基因，從分子水平上研究控制病原菌生長的分子機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 轉(zhuǎn)化材料與質(zhì)粒

將野生型彎孢葉斑病菌CX-3置28℃黑暗培養(yǎng)3 d后收集其分生孢子，配制成濃度為104個·mL-1的彎孢分生孢子懸浮液，然后涂布在玻璃紙上，在30℃黑暗條件下培養(yǎng)6 h后做轉(zhuǎn)化受體材料。用于ATMT轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌質(zhì)粒pBHt-1（AGL-1）為轉(zhuǎn)化供體。

1.2 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化參照劉銅等[12]方法操作，取含有雙元載體的農(nóng)桿菌株接到含有100μg·mL-1潮霉素的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，28℃下震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，得到OD660=0.6的農(nóng)桿菌菌液；然后取農(nóng)桿菌菌液250μL，加到新鮮的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，28℃下振蕩培養(yǎng)過夜至對數(shù)生長期，然后在液體IM培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h，將農(nóng)桿菌菌液濃度調(diào)至OD660=0.2備用。

取誘導(dǎo)后的農(nóng)桿菌菌液與萌發(fā)分生孢子懸浮液等體積混合，涂布于IM（10 mM glucose）固體培養(yǎng)基的玻璃紙上，在黑暗條件下培養(yǎng)數(shù)小時，然后將IM固體培養(yǎng)基上的玻璃紙轉(zhuǎn)移到含有200μg·mL-1的頭孢霉素和潮霉素的PDA平板培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子；將平板培養(yǎng)基在28℃下培養(yǎng)7 d，將能夠抗潮霉素的彎孢霉菌落轉(zhuǎn)移到預(yù)先倒好的含有200μg·mL-1潮霉素的固體PDA培養(yǎng)基上進行2次篩選，第2次篩選得到抗潮霉素的玉米彎孢霉菌落即為轉(zhuǎn)化子。

1.3 轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定性檢測

把篩選到的第二代抗性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到不含潮霉素的PDA上，置28℃下繼續(xù)培養(yǎng)5代后，再轉(zhuǎn)接到含有潮霉素PDA上培養(yǎng)，檢測轉(zhuǎn)化子對潮霉素的抗性。

1.4 PCR檢測與雜交分析

CTAB法提取基因組DNA，其方法參見文獻[12]。PCR反應(yīng)體系（50μL）：Premix Taq 25μL，DNA模板1μL，引物hyg-F：5`-CGACAGCGTCTCCGACCTGA-3`和hyg-R：5`-CGCCCAAGCTGCATCATCGAA-3`各2μL，ddH2O 18μL。PCR擴增條件：94℃ 5 min，94℃1 min，55℃45 s，72℃1 min，共29循環(huán)；1.0%瓊脂糖電泳檢測。雜交分析根據(jù) Southern blotting試劑盒操作說明進行，用HindⅢ酶切過夜，以上述擴增回收的潮霉素基因片段標記為探針。

1.5 生長速度測定

取在篩選培養(yǎng)基上生長速度有明顯變化的轉(zhuǎn)化子，用直徑0.5 cm的打孔器在長滿菌絲PDA平板上打孔，取菌落邊緣生長良好、無污染的菌絲塊，將菌塊分別倒置轉(zhuǎn)接于直徑9 cm PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中央，置28℃培養(yǎng)2 d后，按照十字交叉法每隔1 d測量菌落直徑，每個菌株重復(fù)3次，計算菌落的生長速度。

1.6 產(chǎn)孢能力測定

將野生型菌株和突變體菌株置28℃黑暗培養(yǎng)15 d后，加入20 mL無菌水，用干凈的玻璃片把孢子刮下，用擦鏡紙過濾除去菌絲，定容到50 mL；然后通過血球計數(shù)板計數(shù)，實驗重復(fù)5次。孢子濃度計算公式：孢子的濃度（個·mL-1）=5個中格孢子總數(shù)×5×105。

1.7 離體葉片致病力測定

用直徑0.5 cm的打孔器把突變體打成菌塊，轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d后用雙蒸水洗下孢子，將孢子懸浮液濃度調(diào)制為107孢子·mL-1。剪取健康無病的5葉期玉米自交系黃早四幼苗的第4位葉片，用刀片切成長2×2 cm的小塊放在平鋪濾紙浸入60mg·L-1的6-BA保濕培養(yǎng)皿中，然后在葉片上滴10μL孢子懸浮液，在25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，觀察葉片壞死反應(yīng)，以野生型為陽性對照，清水處理為陰性對照，每次處理12塊葉片，實驗重復(fù)處理3次。

1.8 T-DNA右翼序列分析

用EcoRⅠ、HindⅢ、PstⅠ、SalⅠ和XbaⅠ酶切轉(zhuǎn)化子基因組，其酶切體系50μL如下：基因組20μg；限制性內(nèi)切酶5μL；10×buffer 5μL；用無菌水定容至50μL；然后在37℃酶切過夜，酶切后用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果。如果酶切充分后，加入1/10體積醋酸銨和2-2.5體積乙醇，在-20℃沉淀30 min，置4℃8 000 rpm離心10min，棄上清，沉淀用70%乙醇清洗兩次后真空干燥。最后將沉淀溶于10μL的無菌水中，進行接頭連接。根據(jù)T-DNA右邊界序列設(shè)計一對特異引物S1和S2，分別與接頭引物C1，C2經(jīng)過2次特異PCR擴增?；厥盏?次PCR產(chǎn)生特異性條帶，然后將目標片斷與Ti載體連接，挑取陽性克隆進行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長緩慢型突變體的獲得

經(jīng)過ATMT轉(zhuǎn)化5-7 d后，從篩選培養(yǎng)基可以獲得轉(zhuǎn)化子菌落，而在不含質(zhì)粒的對照處理培養(yǎng)基上不能形成抗潮霉素的菌落（圖1）。

圖1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的彎孢菌轉(zhuǎn)化Fig.1 Agrobacterium-Mediated transformants of C.lunata

將抗性突變體進行穩(wěn)定分析后轉(zhuǎn)移到不含抗生素的PDA培養(yǎng)基生長，發(fā)現(xiàn)一個生長相當緩慢的突變體。將該突變體和野生型菌株分別接到新鮮的PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7 d后觀察突變體和野生型菌株在菌落形態(tài)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體菌落小，菌落邊緣整齊，菌絲致密，其產(chǎn)孢量是野生型菌株18%。為了精確比較突變體與野生型菌株在生長速度上的差異，在PDA上培養(yǎng)2 d后，每隔一天進行菌落大小的測定，結(jié)果表明突變體生長速度是野生型菌株42%（圖2）。

圖2 野生型CX-3與生長緩慢型突變體生長曲線圖Fig.2 Growth Curve figure ofwild type CX-3 and growth-slow mutant

2.2 生長緩慢的突變體的分子鑒定

通過CTAB法提取野生型菌株CX-3及其生長緩慢的突變體的總DNA，根據(jù)已知潮霉素基因hyg-F和hyg-R引物，對突變株進行了PCR檢測。結(jié)果突變株能擴增出抗潮霉素基因的譜帶（811 bp），而出發(fā)菌CX-3沒有擴增出抗潮霉素基因的譜帶，說明質(zhì)粒pBHt1中的T-DNA已成功插入突變株中（圖3）。Southern blotting雜交結(jié)果表明T-DNA以單拷貝形式插入到病原菌的基因組中（圖4）。

圖3 潮霉素基因PCR檢測圖Fig.3 PCR analysis of a slow-growthmutant

圖4 Southern blotting雜交圖Fig.4 Hybridization figure of Southern blotting

2.3 生長緩慢的突變體的產(chǎn)孢量測定

對獲得性狀穩(wěn)定的生長緩慢突變體與野生型產(chǎn)孢量的測定，發(fā)現(xiàn)野生型產(chǎn)孢量平均值為2.2×106孢子·mL-1，而生長緩慢型突變體產(chǎn)孢量為4×105孢子·mL-1，生長緩慢型突變體產(chǎn)孢量是野生型CX-3的18%，明顯低于野生型。

2.4 生長緩慢的突變體的致病力測定

滴有野生型菌株CX-3和突變體葉片經(jīng)過72 h后培養(yǎng)后，其接種葉片都產(chǎn)生明顯的褐色壞死斑，清水對照無明顯病斑，結(jié)果表明生長緩慢型突變體的致病力，與野生型比較，在玉米葉片的致病力沒有差異（圖5），說明病原菌的產(chǎn)孢量和生長速度與致病力沒有相關(guān)性。

圖5 在離體玉米葉片上的致病力測定Fig.5 Pathogenicity assay on detached maize leaf

圖6 生長緩慢突變體T-DNA右翼PCR擴增產(chǎn)物Fig.6 PCR productof the right flanking of T-DNA from a slow-growthmutant

2.5 生長緩慢的突變體T-DNA右翼序列分析

經(jīng)過二次特異PCR后獲取一條大約450 bp的片段（圖6），對該片段進行測序發(fā)現(xiàn)其片段包括一個41 bp完整的T-DNA右邊界序列，說明擴增片段屬于插入T-DNA的基因組片段。將基因序列提交NCBI采用blastn比對后，沒有找到高度同源的基因序列。

3 結(jié)論與討論

創(chuàng)造缺陷型突變體是分離和鑒定相關(guān)基因的一種有效途徑。目前獲得絲狀真菌突變體的方法有紫外誘導(dǎo)、質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化（PEG/CaCl2）、電激轉(zhuǎn)化、基因槍、限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)轉(zhuǎn)化（REMI）和農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化等方法。其中根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）是近年來發(fā)展的一種新的真菌遺傳轉(zhuǎn)化方法，與PEG/CaCl2、基因槍等轉(zhuǎn)化方法相比，該方法具有操作簡便、轉(zhuǎn)化效率高和易得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子等特點，同時T-DNA的插入可為突變基因提供分子標記，為基因的克隆提供便利條件，因此被運用進行反遺傳研究一種有效方法[13-14]。

高等真菌的生長是一個復(fù)雜的過程，許多影響細胞內(nèi)新陳代謝和形成建成的因素都將會影響到真菌的生長和分化。其中G蛋白、幾丁質(zhì)合成酶、運輸?shù)鞍缀蚦AMP及與之相關(guān)的調(diào)控因子已經(jīng)被證明可以控制菌絲體的生長與分化。例如在稻瘟病菌中對一個編碼G蛋白的ɑ亞單位的mag B基因進行定點突變時，發(fā)現(xiàn)突變體的菌絲體不能正常生長，附著胞和孢子不能形成[15]；在煙曲霉（Aspergillus fumigatus）中發(fā)現(xiàn)CHS基因在菌絲的生長和伸長中起重要作用，同時對chs G和chs E基因缺失時發(fā)現(xiàn)其突變體表現(xiàn)為高度的分支，菌絲生長緩慢[16]；在子囊菌赤球叢殼菌Wu等克隆一個與驅(qū)動蛋白具有同源性NhKIN1基因，對該基因進行破壞時發(fā)現(xiàn)其突變體的菌絲波紋狀或螺旋形，其菌落生長率為野生型的50%[17]。另外環(huán)境因子，例如溫度、濕度及水的參透勢也可以在不同程度上影響菌絲的生長[18]。本實驗通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法獲得一個生長緩慢的突變體，并利用接頭PCR技術(shù)獲得該突變體T-DNA右翼序列，今后可繼續(xù)采用接頭PCR技術(shù)獲取T-DNA左翼序列，再通過基因序列的拼接、RT-PCR、RACE技術(shù)獲取該基因的全長序列，這將為深入研究該基因在調(diào)控玉米彎孢葉斑病菌菌絲生長與分化中的作用奠定基礎(chǔ)。

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