陳瑞芳,徐長安,劉麗梅,方衛(wèi)東

(1.廣西海洋研究所 生物工程技術(shù)研究中心,廣西 北海 536000; 2.國家海洋局 第三海洋研究所 海洋生物資源化學(xué)與化工研究中心,福建 廈門 361005; 3.福建省海新集團有限公司,福建 漳州 363102)

水產(chǎn)養(yǎng)殖特別是高密度、集約化養(yǎng)殖過程中,經(jīng)常會發(fā)生水體中亞硝酸鹽含量過高現(xiàn)象,其主要原因往往是投餌管理不善引起的。另外,養(yǎng)殖池底淤泥過多,特別是老化的池底,也會導(dǎo)致養(yǎng)殖水體中的亞硝酸鹽濃度超標(biāo)。水體中過高濃度的亞硝酸鹽,不僅直接危害養(yǎng)殖生物,而且直接導(dǎo)致養(yǎng)殖品種頻繁發(fā)生病害,嚴重威脅養(yǎng)殖的成功和養(yǎng)殖產(chǎn)品的質(zhì)量,是當(dāng)前困擾養(yǎng)殖業(yè)者的主要問題之一[1-3]。因此如何控制、降低養(yǎng)殖水體中的亞硝酸鹽濃度是養(yǎng)殖業(yè)者和水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)人員關(guān)心和需要研究、解決的問題。本實驗室長期跟蹤福建龍海養(yǎng)殖區(qū)亞硝酸鹽對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的影響,并從那里持續(xù)性地篩選反硝化細菌。作者對其中一株高效降解菌 SF1進行了降解特性研究并進行了 SF1用于該養(yǎng)殖區(qū)魚池底泥亞硝酸鹽的降解試驗,為該菌株將來在養(yǎng)殖環(huán)境生物修復(fù)方面的應(yīng)用做技術(shù)準備。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及主要儀器、試劑

供試菌株篩選自福建省龍海養(yǎng)殖區(qū)魚池底泥,根據(jù)菌株的16S rDNA測序,結(jié)合有關(guān)細菌形態(tài)和生理生化特性,初步鑒定其為假單胞菌屬(Pseudomonassp.),命名SF1。

主要儀器、試劑：SpectraMax M5/M5e多功能酶標(biāo)儀; 格利斯試劑。

1.2 亞硝酸鹽濃度的測定

繪制標(biāo)準曲線[4],然后通過測定測試樣品中的吸光度(A)值,比對標(biāo)準曲線計算相應(yīng)的 NO2-N濃度。如果測試樣品中的 NO2-N濃度較高,則先進行稀釋,使相關(guān)數(shù)值落在標(biāo)準曲線范圍內(nèi),比對后所得數(shù)值再乘以稀釋倍數(shù)。

1.3 菌株SF1利用亞硝酸鈉的特性研究

1.3.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)條件

250 mL三角瓶中裝入 100 mL無機鹽培養(yǎng)基(KH2PO40.5 g、K2HPO40.5 g、MgSO4?7H2O 0.2 g、CaC120.1 g、NaC1 0.2 g、MnSO4?H2O 微量、NaNO21.0 g,蒸餾水1 000 mL,pH 7.0),按10%接種量接入預(yù)培養(yǎng)的SF1菌液,36 ℃ 180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)或靜態(tài)培養(yǎng)。

1.3.2 亞硝酸鈉初始濃度對降解的影響

以基礎(chǔ)培養(yǎng)條件,設(shè)定亞硝酸鈉起始濃度分別為 10、50、100、500、1 000、2 000 mg/L,搖床振蕩培養(yǎng)48 h后測量培養(yǎng)液的吸光度(A534)值和NO2-N濃度。

1.3.3 培養(yǎng)時間對降解的影響

以基礎(chǔ)培養(yǎng)條件,并選擇亞硝酸鈉質(zhì)量濃度為 500 mg/L搖床振蕩培養(yǎng),在6、12、24、36和48 h時取樣測量培養(yǎng)液的吸光度(A534)值和NO2-N濃度。

1.3.4 接種量對降解的影響

以基礎(chǔ)培養(yǎng)條件,設(shè)定亞硝酸鈉質(zhì)量濃度為500 mg/L,選擇梯度為1%、5%、10%和15%的接重量接種,振蕩搖床培養(yǎng),36 h時測量培養(yǎng)液的NO2-N濃度。

1.3.5 靜置和搖床培養(yǎng)對降解的影響

以基礎(chǔ)培養(yǎng)條件,選擇亞硝酸鈉質(zhì)量濃度為500 mg/L,分別進行振蕩搖床培養(yǎng)和靜態(tài)培養(yǎng),在12、24、36和 48 h時取樣測量培養(yǎng)液的吸光度(A534)值和NO2-N濃度。

1.4 菌株 SF1對魚池底泥亞硝酸鹽的降解作用

取高污染的魚池底泥,等量放入體積為 0.1 m3的兩個敞口玻璃水槽,然后加入兩倍于底泥體積的網(wǎng)濾海水(取自于魚池進水口),測本底亞硝酸鹽濃度,在其中的一個水槽(實驗組)接種 SF1菌液10%(體積比),另一個空白對照,36 ℃恒溫并中速攪拌,分別于12、24、36、48 h時取樣測NO2-N濃度。

以上實驗,每個水平設(shè)置3個平行樣,數(shù)值取平均值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 11.5軟件進行相關(guān)數(shù)據(jù)的處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞硝酸鹽濃度測定標(biāo)準曲線

配置系列亞硝酸根標(biāo)準液,加入格利斯試劑顯色,在多功能酶標(biāo)儀上選擇A534nm進行比色。以亞硝酸根濃度為橫坐標(biāo),A值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準曲線(圖 1)。

2.2 亞硝酸鈉初始濃度對降解的影響

48 h后培養(yǎng)結(jié)束,取樣所測得的A534值和NO2-N降解率列成如下表1。從表1可以看出SF1對亞硝酸鈉的初始質(zhì)量濃度適應(yīng)范圍很廣,在10～1 000 mg/L 范圍內(nèi),SF1均可進行高效降解,并且隨著亞硝酸鈉濃度的升高,菌體濃度也升高,但當(dāng)亞硝酸鈉質(zhì)量濃度超過1 000 mg/L,尤其是達到2 000 mg/L時,菌體濃度大幅度下降,降解率也迅速下降。

圖1 亞硝酸鹽濃度測定的標(biāo)準曲線Fig.1 Standard curve for nitrite determination

表1 NO2-N初始質(zhì)量濃度對降解效果的影響Tab.1 Effects of the initial concentration on nitrite degradation

2.3 培養(yǎng)時間對NO2-N降解效果的影響

不同培養(yǎng)時間對應(yīng)的A值變化和亞硝酸鈉降解情況表述為圖2和圖3。從圖2可以看出,菌株對亞硝酸鈉的利用良好,表現(xiàn)為生長旺盛,約7 h后即進入對數(shù)生長期,24 h時進入生長穩(wěn)定期,穩(wěn)定期持續(xù)約12 h,然后進入衰亡期。圖4基本反映了菌株生長過程與NO2-N降解的對應(yīng)關(guān)系。NO2-N濃度隨著培養(yǎng)時間的延長而不斷降低,當(dāng)菌株生長處于遲緩期和衰亡期時,NO2-N的降解率較低,而當(dāng)菌株處于快速增殖時,NO2-N快速降解。

圖2 SF1在不同培養(yǎng)時間的A534值Fig.2 A534 value of SF1 in different culture times

圖3 不同培養(yǎng)時間亞硝酸鹽降解效果Fig.3 Effects of culture times on nitrite degradation

2.4 接種量對NO2-N降解效果的影響

圖4表明,菌株SF1對NO2-N的降解率隨著接種量的增加而升高,但遞增關(guān)系止于 10%的接種量之后,即當(dāng)接種量為 10%時,其降解率最高,達到91.2%,當(dāng)接種量超過該數(shù)值時,降解率不再隨之上升。根據(jù)圖4所示,實驗室條件下,SF1降解亞硝酸鈉的最佳接種量為10%。

圖4 接種量對亞硝酸鹽降解率的影響Fig.4 Effects of inoculum volumes on nitrite degradation

2.5 靜置和搖床振蕩培養(yǎng)對降解的影響

靜置培養(yǎng)和搖床振蕩培養(yǎng)兩種方式所測得的菌液A值和亞硝酸鈉降解率變化情況如圖5和圖6所示。顯然,振蕩培養(yǎng)下菌液的A值明顯高于靜置培養(yǎng),其亞硝酸鈉的降解效果也好于靜置培養(yǎng),其中振蕩培養(yǎng)下,12 h之后的降解率都很高,24 h的降解率顯著高于12 h(P＜ 0.01),但24～48 h之間的時間段,降解率差異不顯著(P＞ 0.05)。

2.6 菌株 SF1對魚池底泥亞硝酸鹽的降解作用

經(jīng)測量,底泥液體的初始亞硝酸鹽質(zhì)量濃度為16.3 mg/L。接種SF1之后,降解情況如圖7所示,可以看出,SF1對底泥中的亞硝酸鹽同樣具有很強的降解作用,36 h后去除率可達67.3%,但比起作用于亞硝酸鈉溶液,降解效果明顯下降,原因可能有：(1)底泥成分復(fù)雜,可以提供 SF1更多的底物利用選擇性;(2)SF1對高濃度的亞硝酸鹽降解更加有效和迅速。從圖 7還可看出,對照組的亞硝酸鹽也有少量降解(水體中溶解氧促使的硝化、反硝化正常循環(huán)),36 h后去除率為 7.7%,但其亞硝酸鹽的去除率遠不如實驗組?？紤]到實驗組也存在本底降解,因此其亞硝酸鹽的去除率實際值為57.3%。

圖5 不同培養(yǎng)方式(靜置或振蕩)各時間段的A值Fig.5 A values of each culture mode (standstill or shaking)on nitrite degradation

圖6 不同培養(yǎng)方式(靜置或振蕩)對亞硝酸鹽降解的影響Fig.6 Effect of culture mode (standstill or shaking) at different times

圖7 SF1對魚池底泥亞硝酸鹽的降解作用Fig.7 Nitrite degradation in fish pond sediment by strain SF1

3 討論

利用微生物方法來降解養(yǎng)殖環(huán)境中的亞硝酸鹽,解決因亞硝酸鹽濃度過高而給養(yǎng)殖帶來的一系列問題,被認為是一種治標(biāo)又治本的可行方法及有效途徑,近幾年已在這方面開展大量的研究[5-7],但見諸于報道的功能性微生物多以厭氧菌為主,好氧性功能菌則較少[8],但厭氧反硝化菌在養(yǎng)殖環(huán)境中的應(yīng)用有很大的局限性,原因是在養(yǎng)殖過程往往進行充氣增氧,以保證水中一定量的溶解氧,滿足高密度、集約化養(yǎng)殖的需要,因此厭氧反硝化細菌的反硝化作用就很難充分地發(fā)揮。本研究篩選到的 SF1為好氧性反硝化菌,其好氧屬性在篩選過程已表現(xiàn)出來,而在進行靜置培養(yǎng)和搖床振蕩培養(yǎng)的對比實驗時,振蕩培養(yǎng)的菌株生長活躍,菌量快速增加,降解率也隨之升高,這也證明了菌株SF1為好氧反硝化菌。

最早對好氧反硝化菌的研究是 20世紀 80年代的 Robertson[9],他報道了好氧反硝化細菌和好氧反硝化酶系的存在,并首次分離到多株好氧反硝化菌,其中就有一株隸屬于假單胞菌屬(Pseudamollas)。近年來國內(nèi)外也陸續(xù)篩選到一些好氧反硝化菌,其降解特性和在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用情況各不相同[10-12],如亞硝酸鹽濃度耐受程度,需氧情況及降解效率等,SF1為海洋源中度需氧的反硝化菌,適合于應(yīng)用在當(dāng)前的海水高密度充氣養(yǎng)殖模式,并且其適宜的亞硝酸鹽質(zhì)量濃度范圍很廣,最高耐受上限可達1 000 mg/L,因此該菌株還可用于高污染的、特別是嚴重老化的養(yǎng)殖池底凈化。

好氧反硝化菌的反硝化作用除了受溶解氧影響外,另一個重要影響因素是反硝化菌的接種量,本研究中當(dāng)接種量為 10%時,SF1的反消化作用最強,高于 10%的接種量,亞硝酸鹽的降解率不升反降,原因可能是接種量超過一定數(shù)值時,由于營養(yǎng)競爭關(guān)系,抑制了菌的增長,甚至造成菌體死亡數(shù)增加,從而使其降解率下降。另外,好氧反硝化菌的反硝化作用還與所作用的底物關(guān)系很大,實際應(yīng)用時,由于養(yǎng)殖水體、養(yǎng)殖池底泥或污水污泥等作用底物,成分非常復(fù)雜,因此菌株對其中的亞硝酸鹽的降解效果比起實驗室中單純的亞硝酸鈉作用底物要小很多,本研究中SF1對魚池底泥亞硝酸鹽降解試驗,36 h后的去除率為 57.3%,雖然已具有相當(dāng)?shù)膶嶋H應(yīng)用價值,但造成降解效果下降的原因有待作進一步研究。

另外,假單胞菌屬中的某些菌,如熒光假單胞菌等,具有一定的致病性,因此在對SF1的應(yīng)用開發(fā)之前,還需做進一步的相關(guān)評估和研究。

[1]王鴻泰,胡德高.池塘中亞硝酸鹽對草魚種的毒害及防治[J].水產(chǎn)學(xué)報,1989,13(3)：207-214.

[2]黃翔鵠,李長玲,鄭蓮,等.亞硝酸鹽氮對凡納濱對蝦毒性和抗病相關(guān)因子影響[J].水生生物報,2006,30(4)：466-470.

[3]曲克明,徐勇,馬紹賽,等.不同溶解氧條件下亞硝酸鹽和非離子氨對大菱鲆的急性毒性效應(yīng)[J].海洋水產(chǎn)研究,2007,28(4)：83-88.

[4]國家環(huán)保局水和廢水監(jiān)測分析方法編委會.水和廢水監(jiān)測分析方法(第3版)[M].北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社,1989：260-263.

[5]劉雙紅,孫燕,岑運華,等.采用光合細菌控制水體中亞硝酸鹽的研究[J].環(huán)境科學(xué),1995,16(6)：21-23.

[6]吳偉.應(yīng)用復(fù)合微生物制劑控制養(yǎng)殖水體水質(zhì)因子初探[J].湛江海洋大學(xué)學(xué)報,1997,17(1)：17-20.

[7]吳美仙,李科,張萍華.反硝化細菌及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J].浙江師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2008,31(4)：467-471.

[8]于愛茸,李尤,俞吉安.一株耐氧反硝化細菌的篩選及脫氮特性研究[J].微生物學(xué)雜志,2005,25(3)：77-81.

[9]Robertson L A,Van Nie E W J,Tnrremans R A M,et a1.Simultaneous nitrification and denitrification in aerobic chemostat cultures of thiosphaera pantotropha[J].Applied Anti Environment Microbiology,I988,54(11)：2812-2818.

[10]安健,宋增福,楊先樂,等.好氧反硝化芽孢桿菌篩選及其反硝化特性[J].環(huán)境科學(xué)研究,2010,23(1)：100-105.

[11]景晟,張洪英,張海彬.亞硝酸鈉高效利用茵的分離及其特性研究[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 2006,29(3)：73-78.

[12]Otani Y,Hasegawa K,Hanaki K.Comparison of aerobic denitrifying activity among three cultural species with various carbon sources[J].Water Sci Technol,2004,50(8)：15-22.