王 磊,宿紅艷,楊潤(rùn)亞,王曉杰,林文杰

(魯東大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 煙臺(tái) 264025)

海洋占地球表面積的 71%,在遼闊的海洋中蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源。海洋微生物生活在海洋高鹽、高壓、低溫、低營(yíng)養(yǎng)或無(wú)光照等特殊環(huán)境之中,這就使海洋微生物能產(chǎn)生陸棲微生物所不能產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)新穎、作用獨(dú)特的生物活性物質(zhì)。因此,海洋微生物成為新藥篩選的重要資源,具有廣闊的發(fā)展前景,從海洋微生物中尋找生物活性物質(zhì)已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[1-2]。海洋細(xì)菌是海洋微生物活性物質(zhì)的一個(gè)重要來(lái)源,目前發(fā)現(xiàn)的具有潛在開發(fā)前景的主要包括芽孢桿菌屬(Bucillus)、交替單胞菌屬(Alteromonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)、微球菌屬(Micrococcus)、腸桿菌屬(Enterubacterium)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、著色菌屬(Chromtium)和欽氏菌屬(Chainia)[3]。研究表明,這些海洋微生物可產(chǎn)生抗生素等抗菌活性物質(zhì),對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒等的生長(zhǎng)有著明顯的拮抗作用[4-6]。

目前,病原真菌感染是植物病害的重要原因之一。不少由真菌引起的植物病害用傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥等方法尚不能有效地根治,同時(shí)化學(xué)農(nóng)藥的大量使用容易帶來(lái)環(huán)境污染、土壤酸堿化及肥力下降等弊端。近年來(lái)人們利用對(duì)病原菌具有拮抗活性的微生物或者微生物的代謝物作為生物農(nóng)藥進(jìn)行生物防治成為一種既有效又環(huán)保的新途徑[7-8]。因此,高鹽環(huán)境中的嗜鹽菌作為一類新型的、極具應(yīng)用前景的微生物資源,對(duì)其研究既具有理論意義,又有應(yīng)用價(jià)值[9]。

作者從山東煙臺(tái)近海鹽場(chǎng)鹽池底泥中分離到一株具有抑菌活性的嗜鹽菌,通過對(duì)該菌的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特性以及系統(tǒng)進(jìn)化分析的研究,表明其屬于交替單胞菌。本實(shí)驗(yàn)為豐富生物防治資源以及工業(yè)化生產(chǎn)抗真菌活性物質(zhì)提供了科學(xué)依據(jù),具有潛在藥物開發(fā)利用的價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

實(shí)驗(yàn)菌株 YTW-10分離于山東煙臺(tái)近海鹽場(chǎng)鹽池底泥經(jīng)抗菌活性的初篩對(duì)病原微生物具有明顯的抑制作用,本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g,蒸餾水定容至1 000 mL,調(diào)節(jié)pH至6.8～7.0。固體培養(yǎng)基則需加入瓊脂15～20 g。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g切成條,煮成黏液狀,過濾取汁,葡萄糖20 g,蛋白胨5 g,KH2PO41.0 g,蒸餾水定容至1 000 mL,瓊脂25 g。

2216培養(yǎng)基：酵母膏1 g,蛋白胨5 g,磷酸高鐵0.1 g,NaCl 30 g,蒸餾水定容至 1 000 mL,pH為7.2～7.4,瓊脂 20～25 g。

1.2 方法

1.2.1 菌落形態(tài)觀察

將經(jīng)分離純化的菌株YTW-10接種于LB固體培養(yǎng)基平板上,28℃培養(yǎng)5 d,觀察其菌落大小、顏色、形態(tài)等特征。

1.2.2 生長(zhǎng)條件的測(cè)定

最適鹽度實(shí)驗(yàn)：供試菌株單菌落過夜震蕩培養(yǎng),按照 1%接種量分別接種于 NaCl濃度為 1%、3%、5%、7%、10%、13%、15%的LB液體培養(yǎng)基中,28℃、150 r/min震蕩培養(yǎng) 12 h,測(cè)定培養(yǎng)液光密度值(A578)。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),取其平均值。

最適生長(zhǎng)溫度實(shí)驗(yàn)：將供試菌株單菌落過夜震蕩培養(yǎng),按照1%接種量接種于含3% NaCl 的LB液體培養(yǎng)基中,分別置于4、20、30、37、45、55℃中150 r/min震蕩培養(yǎng) 36 h,測(cè)定培養(yǎng)液光密度值(A578)。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),取其平均值。

pH值對(duì)生長(zhǎng)影響的測(cè)定：供試菌株單菌落過夜震蕩培養(yǎng),按照1%接種量接種于含NaCl為3%,pH值分別為 4、5、6、7、8、9、10的 LB 培養(yǎng)液中 28℃、150 r/min震蕩培養(yǎng) 12 h,測(cè)定培養(yǎng)液光密度值(A578)。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),取其平均值。

1.2.3 生理生化實(shí)驗(yàn)

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[10]和《微生物分類學(xué)》[11]中的有關(guān)方法進(jìn)行生理生化特征的鑒定。

1.2.4 16S rDNA序列測(cè)定與系統(tǒng)進(jìn)化分析

基因組DNA的提?。篩TW-10的基因組DAN提取采用寶生物工程(大連)有限公司的 TaKaRa Mini-BEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0試劑盒。

16S rDNA 序列的 PCR 擴(kuò)增和測(cè)序：以菌株YTW-10基因組DNA為模板,采用正向引物 P1：5’-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG - 3’和反向引物 P2：5’-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3’進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系(25 μL)：10×Buffer 2.5 μL,2.5 mmol/ L MgCl22.0 μL,2.5 mmol/ L dNTP 2.0 μL,TaqDNA 聚合酶 1 U,10 μmol/L 引物各 2.0 μL,5～10 ng基因組DNA,雙蒸水補(bǔ)齊體積。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性10 min,94 ℃變性 1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,循環(huán)35次,72 ℃后延伸5 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Elute milk小量膠回收試劑盒(上海飛捷生物技術(shù)有限公司)純化后,送上海生物工程有限公司測(cè)序。

系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建和分析：將測(cè)定的16S rDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTN相似性搜索,尋找同源序列。將分值較高的序列同本研究獲得的相應(yīng)序列采用DNASTAR軟件包中的MegAlign程序進(jìn)行多序列比對(duì),并采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[12]。

1.2.5 抑菌活性實(shí)驗(yàn)

指示菌株：鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)等水產(chǎn)生物致病細(xì)菌購(gòu)于上海水產(chǎn)大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物病原庫(kù); 玉米彎胞病菌(Curvlaria lunata)、西瓜枯萎病菌(Fusarium ozysporum)和小麥赤霉病菌(Fusarium graminearumSchw)等植物致病真菌由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

指示菌培養(yǎng)基：水產(chǎn)生物致病菌采用2216培養(yǎng)基,植物致病真菌采用葡萄糖土豆(PDA)培養(yǎng)基。

供試菌對(duì)病原細(xì)菌抑菌活性實(shí)驗(yàn)：將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的病原細(xì)菌培養(yǎng)液150 μL均勻涂布在2216固體培養(yǎng)基平皿上,然后在培養(yǎng)基中央上打孔,加入50 μL經(jīng)搖床培養(yǎng)24 h的YTW-10培養(yǎng)液。在30℃的溫箱中培養(yǎng)72 h后,測(cè)量抑菌圈橫向和縱向直徑,取平均值。

供試菌對(duì)病原真菌抑菌活性實(shí)驗(yàn)：將平板培養(yǎng)的指示真菌用打孔器制成圓形菌苔接種到PDA培養(yǎng)基中央,然后在真菌周圍一定范圍內(nèi)均勻打 4個(gè)孔,分別加入50 μL經(jīng)搖床培養(yǎng)24 h的YTW-10培養(yǎng)液,同時(shí)以不加 YTW-10培養(yǎng)液的真菌平板作為對(duì)照。在30 ℃的溫箱中培養(yǎng)72 h,分別測(cè)量對(duì)照皿和供試皿中的真菌菌落直徑,二者的差值即為抑菌直徑[13]。

2 結(jié)果

2.1 菌落形態(tài)觀察

菌株YTW-10在LB固體培養(yǎng)基上菌落形狀為圓形,表面光滑,扁平凸起,邊緣整齊,菌落大小(d/mm)為 1～2,表面濕潤(rùn),白色,不透明。革蘭氏染色陰性。具備《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中交替單胞菌屬的特征。

2.2 生長(zhǎng)條件測(cè)定

將YTW-10接種在不同NaCl濃度的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),繪制其在不同鹽濃度下的生長(zhǎng)曲線。由圖 1可以看出YTW-10可在1%～15 % NaCl濃度的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng),在NaCl濃度為7%左右生長(zhǎng)最好,當(dāng) NaCl濃度在 10%以上時(shí)其生長(zhǎng)量急劇下降,到15%時(shí)幾乎不生長(zhǎng),因此我們將其定義為中度嗜鹽菌。

圖1 YTW-10在不同 NaCl濃度的 LB 培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況Fig.1 Growth of YTW-10 in LB medium with different concentrations of NaCl

從圖 2可以看出YTW-10菌株生長(zhǎng)的溫度范圍較為廣泛,從4 ℃到55 ℃都有不同程度的生長(zhǎng),在30～45 ℃之間生長(zhǎng)較好,在 37℃時(shí)生長(zhǎng)最快;YTW-10的pH值生長(zhǎng)范圍在4～10之間,在4和10時(shí)幾乎不生長(zhǎng),在pH為8時(shí)生長(zhǎng)速度最快(圖3)。

圖2 YTW-10在不同溫度下生長(zhǎng)的情況Fig.2 Growth of YTW-10 at different temperatures

圖3 pH值對(duì)YTW-10生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effects of pH on YTW-10 growth

2.3 理化性質(zhì)實(shí)驗(yàn)

菌株 YTW-10 的生理生化特征如表1所示,可以利用木糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖為唯一碳源生長(zhǎng),但不能利用核糖和阿拉伯糖作為唯一碳源生長(zhǎng); 能以水解明膠作為唯一氮源生長(zhǎng),不能利用酪蛋白為唯一氮源生長(zhǎng); 能產(chǎn)硫化氫,葡萄糖氧化產(chǎn)酸(M.R 反應(yīng)為陽(yáng)性),V.P反應(yīng)為陰性; 其過氧化氫酶、氧化酶、卵磷脂酶為陽(yáng)性,反硝化、精氨酸脫羧、苯丙氨酸脫氨、淀粉水解等實(shí)驗(yàn)均為陰性。

初步鑒定結(jié)果表明,YTW-10的形態(tài)和生理生化特性與交替單胞菌屬較為一致,YTW-10與交替單胞菌的兩個(gè)確定種的生理鑒定結(jié)果的比較見表1。

2.4 基于16S r DNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為進(jìn)一步鑒定 YTW-10,在理化分析的基礎(chǔ)上,對(duì) YTW-10進(jìn)行 16S rDNA序列分析。通過對(duì)YTW-10的16S rDNA序列擴(kuò)增獲得了1 494 bp的序列,并提交到GenBank中(登陸號(hào)為FJ171338)。將該16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blastn比對(duì),結(jié)果表明在前50個(gè)同源性較高的序列中已確定的屬名均為交替單胞菌屬,同源性為 99 %,但全部是未定種。其中比對(duì)分值最高的是Alteromonassp.CF14-3和Alteromonassp.CF11-5的 16S rDNA 序列。與YTW-10同源性最高的已確定種是Alteromonas macleodii,同源性為 97%。選取與 YTW-10同源性較高的代表菌株進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,以交替單胞菌科(Alteromonadaceae)中的另一個(gè)屬假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)為外類群構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)。系統(tǒng)進(jìn)化樹表明YTW-10與所有的Alteromonas聚在一起,其中YTW-10與Alteromonassp.CF14-3的親緣關(guān)系最近。結(jié)合前期完成的培養(yǎng)特征和生理生化特征等實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,我們最終確定 YTW-10為交替單胞菌屬Alteromonas細(xì)菌。

2.5 抑菌實(shí)驗(yàn)

以水產(chǎn)生物致病菌鰻弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌以及植物致病真菌玉米彎胞病菌、 西瓜枯萎病菌和小麥赤霉病菌為敏感指示菌,進(jìn)行拮抗對(duì)峙實(shí)驗(yàn),抑菌譜結(jié)果見表2。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 YTW-10對(duì)水產(chǎn)生物致病細(xì)菌的拮抗作用不明顯,但對(duì)植物致病真菌具有較強(qiáng)的抑菌活性。圖5所示是YTW-10對(duì)不同植物致病真菌生長(zhǎng)的抑制效果,結(jié)果表明沒有接種 YTW-10的植物致病真菌生長(zhǎng)速度較快,長(zhǎng)勢(shì)好; 而接種YTW-10的生長(zhǎng)速度緩慢很多,長(zhǎng)勢(shì)較差。因此,菌株YTW-10對(duì)小麥赤霉病菌、西瓜枯萎病菌和玉米彎胞病菌都有明顯的抑制效果。

表1 菌株YTW-10與相近菌株生理生化特征比較Tab.1 Comparison of physiological and biochemical characteristics between YTW-10 and the related strains

圖4 YTW-10菌株的16S rDNA 序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogentic tree of YTW-10 based on 16S rDNA sequences

3 討論

陸生微生物發(fā)酵產(chǎn)物長(zhǎng)期以來(lái)一直是醫(yī)藥業(yè)和工農(nóng)業(yè)的重要來(lái)源,然而由于該領(lǐng)域研究的深入,近年來(lái)從陸生微生物中尋找新的資源難度越來(lái)越大。另外傳統(tǒng)抗生素的濫用,使得耐藥病原菌不斷出現(xiàn)[16]。由于海洋微生物獨(dú)特的生存環(huán)境,海洋微生物中常蘊(yùn)含著陸生生物所不具備的活性物質(zhì)[17]。 因此,從海洋微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物中尋找開發(fā)有別于陸棲微生物產(chǎn)生的生理活性物質(zhì)已成為當(dāng)前微生物學(xué)研究的一個(gè)重要方向。已有的研究表明海洋細(xì)菌的代謝產(chǎn)物種類繁多,結(jié)構(gòu)新穎多樣,存在著豐富的抗菌資源[18]。我國(guó)海岸線長(zhǎng),海域遼闊,蘊(yùn)含著豐富的海洋微生物資源,需要加強(qiáng)這方面的研究和開發(fā)工作。

表2 YTW-10的抑菌譜Tab.2 Inhibition spectra of YTW-10

圖5 菌株YTW-10對(duì)病原真菌的抑制Fig.5 Antibacterial test

作者從煙臺(tái)海域分離到一株對(duì)植物致病真菌具有明顯拮抗作用的菌株YTW-10,根據(jù)YTW-10的形態(tài)學(xué)特征和生理生化鑒定,YTW-10與交替單胞菌較為接近?；?6S rDNA序列的分子生物學(xué)鑒定顯示,該菌在基因庫(kù)中與未確定種名的Alteromonassp.CF14-3最為接近,相似度達(dá)99%; 與YTW-10最接近的確定種是Alteromonas macleodii,同源性為97%。應(yīng)用 16S rDNA 序列分析法能快速、準(zhǔn)確地對(duì)微生物進(jìn)行分類鑒定,在環(huán)境微生物多樣性研究、菌種鑒定及微生物資源的開發(fā)中得到了廣泛的應(yīng)用,目前隨著分子分類的理論和方法的日趨成熟以及數(shù)據(jù)庫(kù)的日趨完善,它已經(jīng)逐步成為微生物資源調(diào)查和環(huán)境生態(tài)研究的一種強(qiáng)有力的工具。一般認(rèn)為,16S rDNA 序列同源性小于 98%,可以認(rèn)為屬于不同的種[19]。因此,YTW-10有可能是交替單胞菌屬的潛在新種,值得進(jìn)一步研究。

交替單胞菌屬的菌能夠產(chǎn)生多種新穎活性物質(zhì),易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的生產(chǎn),具有廣闊的開發(fā)前景[20]。杜宗軍等[21]從青島近海海水中分離得到的交替單胞菌Alteromonas addita具有降解瓊膠活性。王海麗等[22]利用取自南極的交替單胞菌Alteromonas stellipolaris提取外膜蛋白和脂多糖,研究它們對(duì)黑鯛非特異性免疫功能的影響,發(fā)現(xiàn)可以起到免疫增強(qiáng)劑的作用,能增強(qiáng)黑鯛血清中的抗菌活力、溶菌酶的活力和酚氧化酶活力,顯著提高黑鯛的白細(xì)胞吞噬活性。鄭立等[23]對(duì)從海洋生物、海水和海泥中分離的海洋細(xì)菌進(jìn)行抗菌活性研究,發(fā)現(xiàn)多種交替單胞菌對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、根瘤土壤桿菌具有不同效果的抑菌作用。目前,國(guó)內(nèi)對(duì)交替單胞菌研究相對(duì)較少,特別是在其產(chǎn)生抗病原真菌活性物質(zhì)方面的研究尚屬空白。我們首次對(duì)從煙臺(tái)海域篩選分離得到的 YTW-10開展針對(duì)抗水產(chǎn)致病菌和植物病原菌的活性研究,發(fā)現(xiàn)其具有廣譜的抗植物病原真菌的作用,為豐富生物防治資源以及工業(yè)化生產(chǎn)抗真菌活性物質(zhì)提供了科學(xué)依據(jù)。

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