朱 明,劉兆普,徐軍田茅云翔,姚東瑞

(1.淮海工學(xué)院 海洋學(xué)院,江蘇 連云港 222005; 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 江蘇省海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210095; 3.中國海洋大學(xué) 生命學(xué)院,山東 青島 266003)

滸苔 (Enteromorpha prolifera)是重要的海洋綠藻,屬綠藻門(Chlorophyta)、綠藻綱(Chlorophyceae)、石莼目(Ulvales)、石莼科(Ulvaceae)、滸苔屬(Enteromorpha),生長在海洋沿岸中低潮區(qū)的砂礫、巖石、灘涂和石沼中,在我國野生藻類中資源豐富。滸苔作為食品原料和飼料添加劑開發(fā)潛力很大,日本等國家已經(jīng)將滸苔二次加工為可即食的海苔,又稱綠紫菜。滸苔的世代同型及其對鹽度、溫度、光照和干出條件的廣泛的適應(yīng)性[1-2],使得滸苔有望成為新的海水或半咸水的栽培海藻[3]。同時(shí)滸苔也是筏架養(yǎng)殖的條斑紫菜的主要生態(tài)位競爭者之一,在海水養(yǎng)殖魚類的過程中,滸苔的附著造成網(wǎng)箱網(wǎng)目堵塞,影響了網(wǎng)箱內(nèi)的水體交換減少,導(dǎo)致養(yǎng)殖動物的疾病多發(fā)和網(wǎng)箱使用壽命縮短。以滸苔、石莼等大型綠藻爆發(fā)式漂浮生長所引發(fā)的“綠潮”在世界各地時(shí)有發(fā)生,成為一種新的生態(tài)災(zāi)害。

有研究表明滸苔釋放孢子對鹽度、溫度、光照強(qiáng)度和酸堿度具有廣泛的適應(yīng)性[4]。一些研究還顯示溫度和海浪運(yùn)動能夠?qū)G苔游動孢子和附著孢子造成一定的影響[5-6]。但是關(guān)于孢子的放散時(shí)機(jī)、附著時(shí)限以及低溫干出條件對滸苔及其孢子放散及萌發(fā)影響的研究還未見報(bào)道; 本實(shí)驗(yàn)旨在對上述問題進(jìn)行初步的探索,為綜合利用滸苔資源、防控滸苔附著病害和探索滸苔“綠潮”的發(fā)生機(jī)制提供幫助。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及培養(yǎng)方法

滸苔于2007年3～4月間取自連云港連島海域紫菜筏架,使用滅菌海水反復(fù)沖洗去除表面附著物,在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)暫養(yǎng),培養(yǎng)介質(zhì)為f/2培養(yǎng)基(鹽度30～33,pH 值 8.2～8.3),另外添加 1 mg/L SeO2; 溫度20℃±1℃、光強(qiáng) 60～75 μmol/(m2.s)(光：暗周期為 12L：12D),通入過濾空氣,待孢子囊形成后供實(shí)驗(yàn)用。

1.2 研究方法

1.2.1 滸苔孢子對不同附著基的選擇性實(shí)驗(yàn)設(shè)置

稱取滸苔0.5 g(濕質(zhì)量,下同),經(jīng)過12 h、20℃黑暗干出后重新恢復(fù)培養(yǎng),在250 mL培養(yǎng)液中通入過濾空氣,同時(shí)在水中分別放入塑料片、塑料繩、玻璃片、木片、紫菜養(yǎng)殖網(wǎng)繩、麻繩、草繩和網(wǎng)布作為附著基,材料懸浮或者懸掛于水體中,24 h后觀察各附著材料上孢子吸附情況 (各種材料在放進(jìn)玻璃缸之前都要進(jìn)行煮沸消毒滅菌,材料大小要適中,長約1 cm或者面積1 cm×1 cm,以便于觀察)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行樣。

1.2.2 滸苔孢子放散及附著時(shí)限的測定方法

稱取具有成熟孢子囊的滸苔0.5 g,在20℃下經(jīng)過12 h黑暗干出處理后,放入盛有250 mL f/2培養(yǎng)液的燒杯中,每 2 h取一定量海水并用碘-碘化鉀溶液固定其中的游動孢子(淡綠色近圓形細(xì)胞,直徑5～7 μm,兩根鞭毛),取其中0.1 mL置于浮游植物計(jì)數(shù)框中,在40×10倍(JNOEC XS-212型顯微鏡)下隨機(jī)選取10個(gè)小框計(jì)數(shù)孢子數(shù),取其平均值。同時(shí)在燒杯內(nèi)每隔2 h放入新的塑料片(1 cm×1 cm)并停留2 h,隨機(jī)抽取十個(gè)視野(40×10倍)計(jì)數(shù)附著孢子數(shù),取其平均值,根據(jù)孢子放散高峰與孢子附著峰值的時(shí)間差,推算孢子的最佳附著時(shí)限。

1.2.3 不同溫度干出處理對滸苔活力及其孢子放散能力影響實(shí)驗(yàn)設(shè)置

稱取滸苔 0.5 g,吸干藻體表面水分,并分別用保鮮膜包裹且保持敞口狀態(tài),置于溫度為 20,4,-4,-20℃的黑暗條件下干出和自然失水。每隔一星期取出各個(gè)條件下的樣品 3份,置于正常條件(同 1.1)下培養(yǎng)1周,中間換水1次。

以相對生長率表示藻體活力,按照以下公式求得其相對生長率(relative growth rate,RRG)：

其中Nt為第t天的鮮質(zhì)量,N0為初始鮮質(zhì)量。

通過計(jì)算滸苔干出處理重新入水培養(yǎng)后 4 h游動孢子的數(shù)目,測定不同干出處理后滸苔孢子放散能力,測定方法如1.2.2。

1.2.4 不同溫度干出/沉水處理吸附孢子實(shí)驗(yàn)設(shè)置

將附著孢子的塑料片(10～20個(gè)孢子/視野,40×10倍)置于溫度為20,4,-4和-20℃的干出或沉水條件下黑暗處理,分別在1、2、4、8、16和20 d后取出恢復(fù)培養(yǎng)一周,培養(yǎng)條件同1.1,觀察其萌發(fā)情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用方差分析法(one-way ANOVA,Turkey),設(shè)置顯著水平為P＜ 0.05。

2 結(jié)果

2.1 滸苔孢子在不同基質(zhì)上的附著情況

經(jīng)過24 h的孢子放散附著后,各種材料上都有數(shù)量不等的孢子附著,有些材料上可見淡淡的綠色,計(jì)數(shù)結(jié)果如表1。從表中可以看出,塑料片、紫菜養(yǎng)殖網(wǎng)繩和網(wǎng)布上孢子附著量較多,玻璃片、塑料繩和草繩上附著量中等草繩和木片上附著量最少,可見塑料片、網(wǎng)繩和網(wǎng)布等材料更加適宜于滸苔孢子的附著。塑料片便于進(jìn)行剪切和孢子計(jì)數(shù),因此在后續(xù)的孢子附著與萌發(fā)實(shí)驗(yàn)中采用塑料片作為附著基。

表1 孢子在不同基質(zhì)上的附著數(shù)量Tab.1 The numbers of spores settled on different substrates

圖1 滸苔放散和附著孢子數(shù)目隨時(shí)間的變化Fig.1 The numbers of released and adhered spores over time

2.2 滸苔孢子放散的高峰時(shí)間和最佳附著時(shí)機(jī)的測定

滸苔經(jīng)過12 h 20℃、黑暗干出處理后復(fù)水,孢子的放散和附著數(shù)目隨時(shí)間變化情況如圖1。從圖1中可以看出,滸苔復(fù)水1h左右水中有游動孢子出現(xiàn),隨著孢子不停的放散,培養(yǎng)液中游動孢子密度線性增長,約4 h達(dá)到峰值。之后由于孢子開始附著,同時(shí)放散量減少,培養(yǎng)液中游動孢子密度下降,12 h左右培養(yǎng)液中不再有游動孢子?？梢?滸苔孢子的連續(xù)放散時(shí)間約為1～10 h,最佳放散時(shí)機(jī)約為復(fù)水后 4 h左右。孢子放散后不久便開始附著,放散與附著幾乎同步,隨孢子放散量的增加,孢子附著量也呈線性上升趨勢,并在 6 h左右達(dá)到峰值,此后也隨孢子放散曲線下降而下降,12 h后不再有孢子附著。

2.3 不同干出溫度和時(shí)間對滸苔藻體活力及其孢子放散能力的影響

本實(shí)驗(yàn)用滸苔干出處理后的恢復(fù)生長率來表示滸苔藻體的活力,從圖2中可以看出,干出溫度與干出時(shí)間對滸苔活力存在著不同的影響。在 20℃條件下滸苔干出2周后仍然保持一定的活力,3周后藻體的活力急劇下降,到第4周藻體后腐爛; 其活力要顯著低于低溫干出的藻體(P＜ 0.05)。

圖2 不同溫度條件下干出保存對滸苔的恢復(fù)生長的影響Fig.2 The growth of Enteromorpha prolifera after exposure to treatments at different temperatures

在 4℃、-4℃和-20℃三種低溫條件下干出保存2周到4周滸苔的活力沒有顯著的差異(P＞ 0.05),其第 4周的活力與 20℃干出1～2周時(shí)相似,說明這三種低溫條件更有利于滸苔藻體活力的保持。但到第5周后-20℃條件下干出保存的藻體復(fù)水后的活力明顯高于 4℃和-4℃下的滸苔活力(P＜ 0.05),說明-20℃的低溫條件對保持藻體活力最為有利。

不同溫度干出處理對滸苔復(fù)水后的孢子釋放能力的影響見表2,從表中可以看出：在20℃條件下干出1～3周內(nèi),滸苔仍然保持很高的孢子釋放水平; 第4周之后失去釋放孢子的能力。-20℃的干出1周,其孢子的釋放量很低,隨著干出時(shí)間的延長不斷增加并在3～5周達(dá)到最高水平,隨后出現(xiàn)明顯的下降; 這與在該溫度下的藻體活力的變化趨勢基本相反。4℃和-4℃的干出條件下滸苔孢子的釋放量較低,第 1周基本沒有孢子釋放,第 2～5周也只有少量的孢子釋放,與藻體活力變化趨勢不一致。

表2 不同溫度干出后滸苔的孢子釋放能力與干出時(shí)間的關(guān)系Tab.2 The relationship between the spore release levels of Enteromorpha prolifera and the desiccation times at different temperatures

2.4 不同溫度干出、沉水條件對附著孢子萌發(fā)的影響

表3 不同溫度干出后滸苔附著孢子的萌發(fā)能力與干出時(shí)間的關(guān)系Tab.3 The relationship between the germination levels of settled spores of Enteromorpha prolifera and the desiccation times at different temperatures

附著孢子在經(jīng)過不同溫度干出或沉水處理后,其萌發(fā)情況隨處理時(shí)間的變化情況見表3和表4。從表中可以看出,20℃干出處理組的孢子在4 d內(nèi)可以萌發(fā),而所有低溫處理組的附著孢子在前 8天都能夠萌發(fā); 其中4℃與-20℃干出組在16 d內(nèi)仍然能夠萌發(fā)。20℃條件下沉水處理組的滸苔孢子的萌發(fā)能力明顯高于相同溫度下的干出組; 而4℃與-4℃沉水組與干出組的孢子萌發(fā)狀況基本相同; -20℃沉水組孢子只能在8 d內(nèi)萌發(fā),遠(yuǎn)低于干出組的16 d。上述結(jié)果表明,在沉水狀態(tài)條件下,較高溫度(20℃)有利于孢子的萌發(fā),而在干出條件下低溫更有利于孢子活力的保持。

表4 不同溫度沉水處理后滸苔附著孢子的萌發(fā)能力與處理時(shí)間的關(guān)系Tab.4 The relationship between the germination levels of settled spores of Enteromorpha prolifera and the treatment times at different temperatures in water

3 討論

3.1 滸苔孢子對附著基的選擇性

本實(shí)驗(yàn)通過對附著孢子數(shù)目的檢測考察了滸苔孢子對附著基的選擇性,結(jié)果以塑料片、紫菜養(yǎng)殖網(wǎng)繩和網(wǎng)布為孢子最佳附著基,而玻璃片、塑料繩、草繩上和木皮(刨花)不適于孢子附著。Finlay等[6]研究發(fā)現(xiàn)：緣管滸苔(Enteromorpha linza)的游動孢子(zoo spore)對疏水性的基質(zhì)有較強(qiáng)趨性,但是在親水性的基質(zhì)上附著能力更強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)只有草繩與木皮為親水性基質(zhì),但兩者的孢子附著量并不大,其他材料皆為疏水性的基質(zhì),但并未影響到孢子的附著,說明滸苔孢子對附著基的選擇還存在其他的條件。本實(shí)驗(yàn)中附著孢子較多的三種材料表面都較為粗糙,顯示滸苔孢子對附著基的選擇與其表面粗糙程度存在關(guān)聯(lián)。吳洪喜等[2]實(shí)驗(yàn)得出滸苔在木板上效果最佳,而本實(shí)驗(yàn)中的木皮(刨花)孢子附著效果不佳,由于刨花的表面更加光滑,說明附著基的表面特性比材質(zhì)對于滸苔孢子附著的影響更大。

從形態(tài)結(jié)構(gòu)上看,本實(shí)驗(yàn)中的游動孢子屬于配子階段,但連續(xù)觀察未發(fā)現(xiàn)其相互融合的現(xiàn)象,應(yīng)屬于 Kapraun[7]研究報(bào)道的中性游孢子; 同時(shí)也說明滸苔孢子(配子)萌發(fā)的多態(tài)性[8],這種多態(tài)性是否與環(huán)境誘導(dǎo)因素有關(guān),需要做進(jìn)一步的研究。

3.2 滸苔孢子附著的最佳時(shí)機(jī)

本實(shí)驗(yàn)中滸苔干出復(fù)水后很快釋放孢子,連續(xù)放散孢子時(shí)間約為1～10 h,放散高峰約在4 h左右;孢子附著時(shí)限為滸苔復(fù)水后1～12 h,6 h左右達(dá)到附著量的高峰,孢子附著峰值出現(xiàn)的時(shí)間落后于孢子放散峰值時(shí)間約2 h,由此說明孢子的附著最佳時(shí)機(jī)或者時(shí)滯為孢子放散后2 h左右。游動孢子快速附著的能力可以保證其盡快在沿岸帶基質(zhì)上的定植,避免被海水沖散到離岸較遠(yuǎn)的地方,保證滸苔優(yōu)勢群體的地位。孢子放散與附著的時(shí)間基本處于12 h之內(nèi),最佳附著時(shí)間為6 h左右,與半日潮的潮汐時(shí)間存在著一定程度的吻合,這是否與潮水漲落的周期性在時(shí)空上存在關(guān)聯(lián),有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.3 滸苔對不同溫度干出處理的耐受性

生長在潮間帶的大型海藻,隨著海洋潮汐經(jīng)歷著兩種連續(xù)變化的環(huán)境條件：沉水和干出。當(dāng)?shù)统睍r(shí),潮間帶海藻的生活環(huán)境由水生突然轉(zhuǎn)變?yōu)殛懮?這樣它們面臨著很多的環(huán)境變化,其中最為明顯的就是失水作用,隨著干出時(shí)間的增加,藻體內(nèi)的含水量迅速降低,表面水分的蒸發(fā)導(dǎo)致鹽度顯著增加,同時(shí)高的光強(qiáng)、溫度以及海風(fēng)的流動會加速這種失水作用,并且高溫和高的光強(qiáng)對藻體的光合作用等代謝過程產(chǎn)生直接的影響[7]。但一些潮間帶大型海藻對這種脅迫具有很強(qiáng)的適應(yīng)能力,其體內(nèi)脯氨酸、可溶性糖積累的提高和膜透性的降低對于提高其對低溫的適應(yīng)性和對干出的耐受能力是有重要的幫助[10]。滸苔對失水這種脅迫有很強(qiáng)的適應(yīng)性,在干出的情況下,即使在高溫高光強(qiáng)下也可以存活2～3d[2]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,滸苔對低溫干出的適應(yīng)性更強(qiáng),-20℃保存的藻體即使經(jīng)過5周的時(shí)間的干出及冷凍失水,置于正常條件下恢復(fù)生長仍然保持相對高的生長速率。這可能是由于低溫下細(xì)胞體內(nèi)的水分得到了有效的保存,使細(xì)胞體內(nèi)的鹽濃度維持在一定的水平,使細(xì)胞膜的完整性得到一定程度的保證,而干出或者冷凍失水對細(xì)胞最大的損傷就是細(xì)胞膜的破壞[11]。研究表明潮間帶海藻Ascophyllum nodosum損失 70%以上的水分后會釋放一些有機(jī)、無機(jī)物質(zhì),1%～2%的總干物質(zhì)以有機(jī)碳形式而損失掉,這表明細(xì)胞膜受到破壞[12]。在低溫條件(-4℃,4℃)下藻體的新陳代謝處于較低水平,在-20℃下藻體的新陳代謝幾乎停止,藻體不需要一定的光合作用來維持藻體的生理狀態(tài),這在很大程度上保存了藻體的生理活性。

3.4 不同溫度干出處理對滸苔孢子釋放能力的影響

從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果還可以看出,滸苔成熟藻體經(jīng)過不同溫度的干出保存后仍然能夠釋放孢子,其中20℃條件下可以保持 3周的有效釋放,而滸苔藻體在第 3周已經(jīng)不能恢復(fù)生長,說明滸苔孢子比藻體營養(yǎng)細(xì)胞具有更強(qiáng)的干出耐受能力。-20℃條件下在第 5周仍然有正常的孢子釋放能力,與藻體活力變化趨勢基本一致,但其最大放散量出現(xiàn)在第 3～5周,而不是在第1～2周,可能與-20℃條件下滸苔的冷凍失水較慢有關(guān),吸水膨脹有利于滸苔大量釋放孢子。在 4℃與-4℃干出條件下,藻體活力很高,但孢子放散量很少,可能與其未能如20℃干出或者-20℃冷凍條件下充分失水有關(guān)。

3.5 附著孢子對不同溫度干出處理的適應(yīng)性

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,與較高溫度(20℃)的沉水狀態(tài)條件相比,滸苔附著孢子對低溫和干出處理較為敏感,但仍然可以分別在20℃,4℃,-4℃和-20℃干出4 d,16 d,8 d和16 d后保持萌發(fā)能力; 說明滸苔附著孢子對干出,特別是低溫干出處理具有一定的耐受性。

與其他附著紫菜網(wǎng)繩的大型藻相比[13],滸苔及其附著孢子對干出與冷藏處理具有更強(qiáng)的適應(yīng)能力,通過冷藏消除網(wǎng)繩附著滸苔存在一定的難度; 建議在紫菜采苗時(shí)采取措施避免滸苔孢子附著網(wǎng)繩,或者在苗簾下海時(shí)避開滸苔孢子放散的高峰時(shí)期,以有效預(yù)防滸苔附著病害的發(fā)生。

3.6 滸苔“綠潮”與孢子釋放的關(guān)系

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,滸苔游動孢子在正常條件下的浮游時(shí)間最長為 12 h,并且需要附著后才能萌發(fā); 本實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)游動孢子在浮游狀態(tài)直接萌發(fā)為滸苔幼苗的情況,是否存在其他可能的滸苔游動孢子直接生成綠潮的途徑,有待進(jìn)一步的考察。同時(shí),滸苔及其孢子對干出和低溫條件的耐受性,也為滸苔的異?；虍惖卦鲋成踔翆?dǎo)致“綠潮”形成提供了可能性,作者將在以后的實(shí)驗(yàn)和野外調(diào)查過程中進(jìn)行深入的研究。

[1]張寒野,吳望星,宋麗珍,等.滸苔海區(qū)試栽培及外界因子對藻體生長的影響[J].中國水產(chǎn)科學(xué),2006,13(5)：781-786.

[2]吳洪喜,徐愛光,吳美寧.滸苔實(shí)驗(yàn)生態(tài)的初步研究[J].浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2000,19(3)：230-234.

[3]Moll B,Deikman J.Enteromorpha clathrata：a potential seawater-irrigated crop [J].Bioresource Technology,1995,52：255-260.

[4]王建偉,閻斌倫,林阿朋,等.滸苔(Enteromorpha prolifera)生長及孢子釋放的生態(tài)因子研究[J].海洋通報(bào),2007,26(2)：60-65.

[5]Taylor,R.Fletcher,R L.A simple method for the freeze-preservation of zoospores of the green macroalgaEnteromorpha prolifera[J].J Appl Phycol,1999,11：257-262.

[6]Finlay J A,Callow M E,Linnea K I,et al.The Influence of Surface Wettability on the Adhesion Strength of Settled Spores of the Green AlgaEnteromorphaand the DiatomAmphora[J]. Integr Comp Biol,2002,42：1116-1122.

[7]Kapraun D F.Field and cultural studies ofUlva and Enteromorphain the vicinity of Port Aransas [J].Texas Contributions in Marine Science,1970,15：205-285.

[8]王曉坤,馬家海,葉道才,等.滸苔(Enteromorpha prolifera)生活史的初步研究[J].海洋通報(bào),2007,26(5)：112-116.

[9]鄒定輝.脫水對滸苔光合作用的影響[J].湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2001,21(2)：30-34.

[10]吳以平,董樹剛.鈣對高鹽脅迫下緣管滸苔和孔石莼生理生化過程的影響[J].海洋科學(xué),2000,24(8)：11-14.

[11]Dring M J,Brown F A.Photosynthesis of intertidal brown algal during and after periods of emersion：a renewed search for physiological causes of zonation[J].Mar Ecol Prog Ser,1982,8：301-308.

[12]Moebus K,Johnson K M,Sieburth J M.Rehydration of desiccation intertidal brown algae：release of dissolved organic carbon and water uptake[J].Mar Biol,1974,26：127-134.

[13]陳昌生,翁琳,汪磊,等.干露和冷藏對壇紫菜及雜藻存活與生長的影響[J].海洋學(xué)報(bào),2007,29(2)：131-136.