張 柯,丁翠玲,張 棟

(山東大學(xué) 威海分校 海洋學(xué)院,山東 威海 264209)

貝類屬于軟體動(dòng)物門,全世界貝類現(xiàn)存1.1萬種左右,其中 80%生活于海洋中,它是自然界生物中僅次于昆蟲類的第二大族類。貝類中絕大多數(shù)種類均可食用,很多貝類的肉質(zhì)肥嫩,鮮美可口,營養(yǎng)豐富。海洋貝類已發(fā)展為海水養(yǎng)殖的重要對(duì)象,產(chǎn)量也極為可觀。不少貝類是不可缺少的優(yōu)良中藥材,如珍珠和珍珠層粉、鮑的貝殼石決明、寶貝的貝殼海巴、烏賊的內(nèi)殼海鰾蛸、海兔的卵群等。與陸生生物的次生代謝產(chǎn)物相比,海洋生物由于生活環(huán)境復(fù)雜門類多樣化,其天然產(chǎn)物具有很多新型的結(jié)構(gòu)骨架和獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu),也具有更強(qiáng)烈的生物活性。隨著研究的逐步深入,不少學(xué)者發(fā)現(xiàn)相當(dāng)一部分海洋動(dòng)植物中的活性物質(zhì)來源于其附生微生物。由于海洋微生物具有可產(chǎn)生種類多樣、結(jié)構(gòu)新穎的活性物質(zhì)及易于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的特點(diǎn),所以海洋微生物作為活性物質(zhì)的可持續(xù)性資源正日益受到國內(nèi)外學(xué)者的重視[1-2]。

我國是世界貝類養(yǎng)殖大國,形成規(guī)模養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)貝類有近20種,貝類養(yǎng)殖已經(jīng)成為威海市海水養(yǎng)殖業(yè)的支柱之一。但是隨著我國沿海城市工業(yè)的迅速發(fā)展,向海洋排放的廢棄物日益增多,部分水域已受到不同程度的污染。貝類的生長位置比較穩(wěn)定,一旦遇到水質(zhì)污染,較易受到污染。再者雙殼貝類屬于濾食性生物,在濾食餌料生物的同時(shí),也將水中的有害物質(zhì)吸入體內(nèi)。食用不潔貝類極易引發(fā)疾病,從而局部暴發(fā)食品中毒事件。我國政府近年來對(duì)食品安全十分重視,并積極采取多種措施,加強(qiáng)對(duì)貝類的衛(wèi)生管理,確保貝類的食用安全。為了解海洋貝類產(chǎn)品的衛(wèi)生狀況以及消費(fèi)者食用貝類產(chǎn)品受微生物污染的危害程度,作者就威海近海主要海洋貝類進(jìn)行附生微生物區(qū)系分析,對(duì)其食用安全性做出正確的評(píng)價(jià),不僅可以為有效保證貝類食用安全提供理論依據(jù),還可增強(qiáng)貝類貿(mào)易市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力,對(duì)完善和提高我國貝類安全管理水平,保證國民身體健康和在國際貿(mào)易中維護(hù)自身利益均有重大意義[3-4]。

本實(shí)驗(yàn)從山東威海近海海域多處地點(diǎn)采集 6種具有代表性海洋貝類,對(duì)其附生細(xì)菌進(jìn)行多樣性分析,以實(shí)驗(yàn)室保藏鰻弧菌 W1為指示菌篩選出其中具有較強(qiáng)抗菌活性的菌株,為進(jìn)一步開展海洋微生物抗菌活性物質(zhì)的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

實(shí)驗(yàn)所需樣品貝類均于2010年4～6月采自山東威海近海海域、小石島養(yǎng)殖場(chǎng)和不同的貝類人工養(yǎng)殖場(chǎng)等多個(gè)不同地點(diǎn)。采集時(shí)用塑料袋裝取適量海水運(yùn)輸以保持其鮮活。在采樣2 h內(nèi)將樣品處理[5]。

1.2 培養(yǎng)基

2216E培養(yǎng)基：蛋白胨5 g,酵母粉1 g,檸檬酸鐵0.1 g,陳海水1 000 mL,pH 7.6。

TCBS培養(yǎng)基：TCBS合成培養(yǎng)基加水溶解[6]。

1.3 附生細(xì)菌的分離

首先用無菌海水反復(fù)沖洗樣品,用鑷子無菌操作取出貝肉,用無菌海水反復(fù)沖洗。稱取3～5g樣品放入研磨器內(nèi),加3 mL無菌海水充分研磨。將研磨液用無菌海水稀釋為 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5五個(gè)濃度。用涂布棒均勻涂布于2216E培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)96 h。挑取不同菌落于2216E平板上劃線分離,以獲得純培養(yǎng)。將分離的不同菌株接種于 TCBS培養(yǎng)基上,觀察菌株是否能夠生長及其菌落形態(tài)。利用-80℃冰箱保藏菌種[7]。

1.4 抗菌活性篩選

以實(shí)驗(yàn)室保藏菌種 W1為實(shí)驗(yàn)用敏感指示菌,用平板點(diǎn)種法篩選具有抑菌活性菌株。以 DH5α作為陰性對(duì)照,以實(shí)驗(yàn)室保藏 A18為陽性對(duì)照。培養(yǎng)皿置于28℃培養(yǎng)48 h。根據(jù)抑菌圈大小判斷抑菌活性。

1.5 16S rDNA序列測(cè)定和分析

1.5.1 PRC模板DNA的制備

將細(xì)菌接種于2216E平板上,28℃培養(yǎng)過夜。取單一菌落懸浮于20μL無菌蒸餾水中。于100℃水浴加熱10 min,立即放入冰水混合物中。

1.5.2 16S rDNA基因序列的PCR擴(kuò)增與測(cè)序

擴(kuò)增16S rDNA的正向引物為27F：5′-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3′,反向引物1492R：5′-TACGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3′在 50 μL的PCR反應(yīng)體系中含有：1×PCR緩沖液,1.5 mmol/L MgC12,4×dNTP混合物各 200 μmol/L,引物各 0.5μmol/L,Taq DNA 聚合酶 0.8 μL(5U/μL),1 μLDNA原液。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性6min; 接94℃變性45 s,55℃退火45 s,72℃延伸90 s,35個(gè)循環(huán);最后72℃溫育8 min,4℃保存[7]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,直接交由北京三博遠(yuǎn)志生物有限責(zé)任公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.5.3 序列分析及數(shù)據(jù)處理

將測(cè)定的基因序列輸入GenBank,獲得收錄號(hào)。并運(yùn)用 Blast程序與數(shù)據(jù)庫中已存在的細(xì)菌 16S rDNA序列進(jìn)行相似性比較分析。利用MEGA4.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹,確定其系統(tǒng)發(fā)生學(xué)地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的篩選

根據(jù)菌落在2216E培養(yǎng)基及TCBS培養(yǎng)基上的形態(tài)、大小、顏色等表觀特征,選取不同類型的有代表性的菌落,從采集自威海近海的 6種代表性貝類中共分離得到100株海洋細(xì)菌。挑取這些海洋細(xì)菌,平板劃線純化至單菌落。利用-80℃冰箱保藏菌種。

2.2 16S rDNA序列測(cè)定

從分離到的100株細(xì)菌中選出43株有代表性的純培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增和測(cè)序,將測(cè)得的序列提交到 GenBank,獲得收錄號(hào)(HQ443218、HQ538732-HQ538773),利用 Blaster進(jìn)行相似性比較[8]。利用 MEGA4.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析,結(jié)果見圖1。

結(jié)果顯示,測(cè)序的45株細(xì)菌分別屬于21個(gè)屬,Psychrobacter屬分布最多有 7株,5株分布在Pseudoalteromonas屬,Arthrobacter,Vibrio兩個(gè)屬分別有4株。其中ZH18與Micrococcus luteus具有最高同源性,但兩者有明顯的區(qū)別,可能為潛在的新種。杜宗軍等[9]從海葵中分離到的56株細(xì)菌分屬于Pseudoalteromonas,Colwellia,Vibrio,Acinetobacter,Pseudomonas,Endozoicomonas,Roseovarius,Paracoccus,Loktanella,Leisingera,Sulfitobacter,Bacillus,Staphylococcus,Plantibacter,Microbacterium,Micrococcus,Joostella,Psychroserpens,Cellulophaga,Krokinobacter,Polaribacter和Psychrobacter共22個(gè)屬。分布于Pseudoalteromonas屬的菌株最多,達(dá)到了16株,4株屬于Vibrio屬,有7株與已發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的最高相似度在97%以下,可以認(rèn)為是潛在的新種。在分離到的56株細(xì)菌中17株可產(chǎn)蛋白酶,20株產(chǎn)脂肪酶,NQ8對(duì)指示菌具有很強(qiáng)的拮抗作用。通過兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果對(duì)比可分析出,海洋動(dòng)物附生細(xì)菌多分布在Pseudoalteromonas屬,Vibrio屬也有較多分布,其中一些菌株對(duì)弧菌屬有較強(qiáng)拮抗作用。目前,可根據(jù)海洋動(dòng)物體內(nèi)弧菌屬細(xì)菌的分布情況對(duì)其食用安全性做出正確的評(píng)價(jià)。一些病原性弧菌常可在扇貝的育苗期大量繁殖,引起貝類幼苗的疾病,短時(shí)間內(nèi)可使貝苗大量下沉、死亡,造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。通過本次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以分析出,自然海域及人工養(yǎng)殖場(chǎng)的海洋貝類附生細(xì)菌中不同程度的都存在對(duì)人類健康產(chǎn)生威脅的致病菌,人們?cè)谑秤煤Ｑ筘愵悤r(shí),應(yīng)充分加工殺滅其中的病原性微生物以保證食用的安全性。

圖1 威海近海海洋貝類附生細(xì)菌及其他相關(guān)細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Neighbour-joining tree of bacteria attached on the marine shellfish isolated from Weihai coast and some related strains

圖2 SA10對(duì)Vibrio gallicus V8產(chǎn)生的抑菌圈(圖中4所示)Fig.2 Inhibition zones produced by SA10 (marked as 4) to Vibrio gallicus V8

2.3 弧菌拮抗菌的篩選

采用平板點(diǎn)種法,以實(shí)驗(yàn)室保藏弧菌 W1 (Vibrio anguillarum)、V8(Vibrio gallicus)為實(shí)驗(yàn)指示菌,對(duì)從海洋貝類中分離到的 100株細(xì)菌進(jìn)行抗菌活性篩選。抑菌實(shí)驗(yàn)篩選出 2株具有較高抗菌活性菌株SA10及 ZH18。兩株具高抗菌活性的菌株分別屬于Pseudoalteromonas和Micrococcus兩個(gè)屬。

3 討論

從威海近海 6種海洋貝類中篩選分離出 100株附生細(xì)菌,根據(jù)菌株的顏色、表面狀態(tài)、邊緣形狀、是否透明等表觀特征從中選出 43株進(jìn)行了 16S rDNA序列測(cè)定和分析。其中 36株細(xì)菌可鑒定到種[7]。這43株細(xì)菌分布在21個(gè)屬中,其中有7株分布在Psychrobacter屬,5株分布在Pseudoalteromonas屬,Arthrobacter,Vibrio兩個(gè)屬分別有4株。

從以上結(jié)果可以看出,威海近海貝類附生細(xì)菌具有較大的多樣性。各份樣品中均檢出了一定數(shù)量的致病菌,隨著在食物鏈中的傳遞與積累,必將由此引起人類的健康問題,這提醒我們要高度重視海洋貝類的食用安全。我們應(yīng)對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境的衛(wèi)生安全引起足夠重視,在食用海洋貝類時(shí)應(yīng)充分加熱以達(dá)到食用安全,海洋貝類的食品安全問題是一個(gè)需要我們長期關(guān)注的重要課題。

貝類因其棲息環(huán)境、攝食方式等限制,成為微生物的良好宿主。海洋貝類中的附生微生物與宿主之間有著緊密的聯(lián)系。某些附生微生物可以產(chǎn)生抗生素以利于一些防御能力較差的宿主在復(fù)雜的海洋環(huán)境中生存。其中有很多結(jié)構(gòu)新穎的活性物質(zhì)是潛在的新藥來源。

我國海域面積廣闊,海洋貝類更是分布廣泛、種類繁多。海洋貝類體內(nèi)多樣的微生物是開發(fā)海洋貝類活性物質(zhì)及海洋藥物潛在的寶貴資源。海洋貝類附生細(xì)菌多樣性分析是對(duì)其開發(fā)利用的基礎(chǔ),但其中大多數(shù)還處于非培養(yǎng)狀態(tài),相信隨著現(xiàn)代微生物技術(shù)的迅猛發(fā)展,可培養(yǎng)的細(xì)菌種類會(huì)越來越多,新類別細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)有利于人們對(duì)于海洋微生物的開發(fā)工作,相關(guān)的進(jìn)一步研究有待更多學(xué)者的不斷研究。

致謝：本研究承蒙我的指導(dǎo)老師杜宗軍副教授及苗婷婷女士指導(dǎo)完成,感謝他們的熱心指導(dǎo)和大力幫助,謹(jǐn)致謝忱。

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