陳吳西， 蔡敬民， 邱 濤， 張利兵， 葉 明

(1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥 230009;2.合肥學(xué)院生物與環(huán)境工程系，安徽合肥 230022)

0 引 言

真菌多糖是從真菌子實(shí)體、菌絲體、發(fā)酵液中分離出的，能夠控制細(xì)胞分裂分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)衰老的一類活性多糖[1]。大量研究表明，多糖具有免疫增強(qiáng)與調(diào)節(jié)、抗病毒、抗放射、抗腫瘤、抗凝血、抗衰老以及抗氧化等作用[2-5]，是公認(rèn)的安全低毒活性物質(zhì)。

利用微生物生產(chǎn)多糖可以不受季節(jié)變化的影響，微生物多糖的收集與純化相對(duì)其它多糖而言更容易[6]，微生物多糖越來(lái)越受到人們的關(guān)注。粒毛盤菌屬Lachnum Retz是晶杯菌科(H ya-loscyphaceae)真菌，其分布廣泛，通常腐生在各種植物基質(zhì)上。近十幾年來(lái)，我國(guó)學(xué)者在粒毛盤菌方面做過(guò)不少研究[7-10]，人們發(fā)現(xiàn)粒毛盤菌屬中有的種能產(chǎn)生生物活性物質(zhì)，說(shuō)明粒毛盤菌具有重要的應(yīng)用前景[11-13]。本文對(duì)一株粒毛盤菌YM 328發(fā)酵條件以及其胞外多糖抗氧化活性進(jìn)行了研究，以期為盤菌多糖的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株及培養(yǎng)基

粒毛盤菌(Lachnum)YM 328，合肥工業(yè)大學(xué)微生物資源與應(yīng)用研究室分離保藏菌種。

發(fā)酵培養(yǎng)基:液體PDA培養(yǎng)基。

1.2 YM 328胞外多糖的發(fā)酵、提取和測(cè)定

搖瓶培養(yǎng)條件為溫度25℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，裝液量50 m L(容積為150 m L的三角瓶)，在此條件下培養(yǎng)10 d。

提取方法:將50m L發(fā)酵液過(guò)濾，濾液濃縮，加3倍體積的無(wú)水乙醇，4℃下醇沉。離心除去上清液，沉淀用蒸餾水溶解并定容至50 m L，加1m L 30%的H 2O2，50℃保溫脫色，Sevage法脫蛋白[14]，得到胞外多糖溶液。

采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖質(zhì)量濃度[15]，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物，用721E型可見(jiàn)光光度計(jì)作比色分析。

1.3 YM 328胞外多糖發(fā)酵條件

1.3.1 碳、氮源對(duì)菌株YM 328多糖發(fā)酵的影響

分別用20 g/LCMC-Na、蔗糖、淀粉、麥芽糖代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖配制不同碳源培養(yǎng)基各50 m L，裝入150 m L的錐形瓶中，用打孔器接入直徑為3mm的菌塊，25℃、150 r/m in搖床培養(yǎng)10 d，測(cè)定多糖質(zhì)量濃度。分別以5 g/L蛋白胨、NH4NO3、(NH4)2SO4、尿素、酵母膏為氮源[16]，并選擇最適碳源配制發(fā)酵培養(yǎng)基，方法同上。

1.3.2 金屬離子對(duì)YM 328多糖發(fā)酵的影響

選擇最適碳氮源配制發(fā)酵培養(yǎng)基，分別添加0.01 g/L硫酸錳、硫酸亞鐵、硫酸鋅、硫酸銅和硫酸鎂，以不加金屬離子的發(fā)酵液為對(duì)照。調(diào)節(jié)pH值為最適，接種菌齡相同菌塊裝于50m L不同生長(zhǎng)因子發(fā)酵培養(yǎng)基的 150 m L錐形瓶中，25℃、150 r/m in搖床培養(yǎng) 10 d，測(cè)定多糖質(zhì)量濃度。

1.3.3 時(shí)間對(duì)YM 328多糖發(fā)酵的影響

選擇最適碳氮源和最佳生長(zhǎng)因子配制發(fā)酵培養(yǎng)基，并調(diào)節(jié)最適pH值，接入直徑3 mm的菌塊，25℃、150 r/m in搖床培養(yǎng)6、8、10、12、14 d，測(cè)定多糖質(zhì)量濃度。

1.3.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以碳源、氮源、金屬離子為3因素，各取4個(gè)水平，選擇L16(45)正交表進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4 YM 328胞外多糖抗氧化活性測(cè)定

1.4.1 胞外多糖對(duì)?OH的清除作用

按照Sm irnoff的方法(有改動(dòng))，利用H2 O2與Fe2+混合產(chǎn)生?OH，在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉?OH并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510 nm下有最大吸收。反應(yīng)體系中含 8.8 mmo l/L H2O2、9mmol/L FeSO4、9mmol/L水楊酸/乙醇、不同質(zhì)量濃度(10、20、30、40、50、60 mg/L)的多糖溶液各1 m L，最后加H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，37℃反應(yīng)0.5 h，以蒸餾水為參比，在510 nm下測(cè)量不同質(zhì)量濃度下的吸光度?？紤]到多糖本身的吸光值、以9 mm ol/L FeSO4、9 mmol/L水楊酸/乙醇、不同質(zhì)量濃度的多糖溶液和蒸餾水各1m L做為多糖的本底吸收值[17]。

清除率計(jì)算公式為:

其中，A0為空白對(duì)照液的吸光度;A x為加入多糖溶液后的吸光度;A x0為不加顯色劑H2 O2多糖溶液本底的吸光度。

[18]的方法進(jìn)行。取3m L不同質(zhì)量濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L)多糖溶液，2m L PBS溶液(pH值為 6.0)和 0.1 m L 200μg/m L NaNO2溶液于試管中，用水添加至10 m L后，將混合液置于37℃恒溫1 h。然后與等容積的G riess試劑(1%對(duì)氨基苯磺酸、0.1% N-1-萘基乙二胺、2.5%H3PO4)混合，靜置10 m in后，蒸餾水做參比，于538 nm處測(cè)其吸光度，同時(shí)測(cè)定對(duì)照樣(不含亞硝酸鈉，含有多糖)和空白樣(不含多糖，蒸餾水代替多糖)吸光度。VC作為樣品對(duì)照。亞硝酸鈉的清除活性公式為:

其中，S a為亞硝酸鈉的清除率;ODs為空白樣品的OD值;ODp為試驗(yàn)的OD值;ODc為對(duì)照的OD值。

2 結(jié)果和分析

2.1 碳、氮源對(duì)YM 328胞外多糖發(fā)酵的影響

當(dāng)以5 g/L蛋白胨為氮源，20 g/L麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖和CMC-Na為碳源時(shí)，YM 328胞外多糖產(chǎn)量如圖1a所示。從圖1a可看出，以葡萄糖為碳源時(shí)，YM 328胞外多糖產(chǎn)量最高，說(shuō)明以葡萄糖為碳源便于菌株YM 328的利用和多糖的積累。氮源對(duì)菌株YM 328胞外多糖產(chǎn)量的影響較大。當(dāng)以葡萄糖為碳源，酵母膏為氮源時(shí)，YM 328胞外多糖的產(chǎn)量最高，達(dá)到1.841mg/m L，如圖1b所示。

圖1 碳氮源對(duì)YM 328胞外多糖產(chǎn)量的影響

2.2 金屬離子對(duì)YM 328胞外多糖發(fā)酵的影響

金屬離子對(duì)菌株YM 328胞外多糖發(fā)酵的影響如圖2所示。由圖2可知，除Cu2+外，添加Mg2+、Fe2+、Zn2+、M n2+對(duì)YM 328胞外多糖的產(chǎn)量都有很大的影響，由此可以推測(cè)金屬離子對(duì)于多糖的合成起重要作用，具體機(jī)理尚待研究。

圖2 金屬離子對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響

2.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)YM 328胞外多糖發(fā)酵的影響

培養(yǎng)時(shí)間對(duì)YM 328胞外多糖發(fā)酵的影響如圖3所示。由圖3可知，YM 328胞外多糖發(fā)酵到10 d時(shí)，其產(chǎn)量達(dá)到1.548 mg/m L，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖產(chǎn)量較穩(wěn)定，直到14 d后多糖產(chǎn)量有所下降。

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響

2.4 正交試驗(yàn)

YM 328胞外多糖發(fā)酵的正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果見(jiàn)表1所列。

表1 YM 328胞外多糖發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，影響YM 328胞外多糖產(chǎn)量的因素依次是C(金屬離子)＞B(氮源)＞A(碳源)。由試驗(yàn)結(jié)果可直接得其最佳組合為A3B3C2，最佳發(fā)酵條件為:ρ(葡萄糖)=20 g/L，ρ(酵母膏)= 5 g/L，ρ(硫酸錳)=0.075 g/L。這與直觀分析所得試驗(yàn)多糖產(chǎn)量最大有差異，故進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)得出胞外多糖最大產(chǎn)量為1.895m g/m L。

2.3.1.2 術(shù)后6周后Harris髖關(guān)節(jié)功能評(píng)分 納入了4個(gè)研究，共179例(SuperPATH組89例，傳統(tǒng)入路組90例)，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，研究間有異質(zhì)性 ( I2>50%)，采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行統(tǒng)一Meta 分析。結(jié)果顯示：SuperPATH組術(shù)后6周后Harris髖關(guān)節(jié)功能評(píng)分優(yōu)于傳統(tǒng)入路組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(WMD=7.62，95%CI=2.09～13.16，P=0.007)。見(jiàn)圖2。

方差分析見(jiàn)表2所列。由表2可以看出，A因素對(duì)該多糖的產(chǎn)率沒(méi)有顯著影響，B因素對(duì)該多糖的產(chǎn)率具有顯著影響，C因素對(duì)其產(chǎn)量具有高度顯著影響。

表2 方差分析

2.5 YM 328胞外多糖對(duì)?OH的清除作用

YM 328胞外多糖對(duì)?OH的清除如圖4所示，由圖4可知，YM 328多糖對(duì)?OH有清除作用，而且隨著質(zhì)量濃度的增加，對(duì)?OH的清除作用增強(qiáng)，且清除能力均高于等質(zhì)量濃度的VC。

圖4 YM 328胞外多糖對(duì)?OH的清除作用

2.6 YM 328胞外多糖對(duì)亞硝基的清除作用

YM 328胞外多糖對(duì)亞硝基的清除如圖5所示，由圖 5可知，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，YM 328胞外多糖對(duì)亞硝基的清除作用逐漸增強(qiáng)，但清除能力均弱于等質(zhì)量濃度的VC。當(dāng)質(zhì)量濃度為1 g/L時(shí)，兩者對(duì)亞硝基的清除能力差異較大，分別為51.07%和65.32%。

圖5 YM 328胞外多糖對(duì)亞硝基的清除作用

3 結(jié)束語(yǔ)

本研究表明，碳源、氮源、金屬離子及培養(yǎng)時(shí)間對(duì) YM 328胞外多糖產(chǎn)量都有不同程度的影響。在最佳發(fā)酵條件下，多糖產(chǎn)量比在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)條件下培養(yǎng)10 d的產(chǎn)量提高了36.27%，說(shuō)明發(fā)酵條件對(duì)YM 328多糖代謝具有重要的調(diào)控作用。

YM 328胞外多糖對(duì)?OH和亞硝基離子的清除作用隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，呈增強(qiáng)的趨勢(shì)。?OH是生物體內(nèi)主要的活性自由基，由它引發(fā)的體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化是機(jī)體衰老、心血管病及腫瘤發(fā)生的重要原因[19]。文獻(xiàn)[20]報(bào)道大球蓋菇多糖(質(zhì)量濃度為583.1 mg/L)對(duì)?OH的清除率為50%，而在本研究中40 mg/L的YM 328胞外多糖對(duì)?OH的清除率就已達(dá)到50.98%，這說(shuō)明粒毛盤菌胞外多糖對(duì)?OH的清除作用較強(qiáng)，是一種很有開發(fā)潛力的抗氧化、防衰老的活性物質(zhì)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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