鄭立紅，陳 萍，梅慶步，劉 楓，吳 楠

（齊齊哈爾醫(yī)學院，黑龍江齊齊哈爾 161006）

趨化因子在卵巢癌組織中的表達及其意義

鄭立紅，陳 萍，梅慶步，劉 楓，吳 楠

（齊齊哈爾醫(yī)學院，黑龍江齊齊哈爾 161006）

目的：探討卵巢癌組織中趨化因子（RANTES）蛋白與mRNA的表達水平及臨床意義。方法：采用免疫組化法和原位雜交技術(shù)檢測卵巢癌組織中RANTES蛋白和mRNA表達，分析其與卵巢癌生物學特征之間的關(guān)系。結(jié)果：RANTES蛋白在卵巢癌及轉(zhuǎn)移灶中的陽性率明顯高于卵巢良性腫瘤，兩組差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）。RANTES mRNA在卵巢癌及卵巢良性腫瘤中的陽性率分別為75.55%和11.76%，兩組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。RANTES蛋白與mRNA表達與癌的組織學分級及TNM分期有關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論：RANTES蛋白在卵巢癌中有陽性表達，其表達水平與卵巢癌侵襲發(fā)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

卵巢癌；RANTES；原位雜交；免疫組織化學

卵巢癌（ovarian carcinoma，OC）是女性生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤。在腫瘤微環(huán)境內(nèi)免疫效應細胞的活化及定向遷移過程中，趨化因子發(fā)揮著重要的調(diào)控功能。趨化因子是一種能夠結(jié)合到靶細胞上特異性G蛋白偶聯(lián)受體的化學誘導因子，其參與調(diào)節(jié)生理性和病理性白細胞遷移。其中受激活調(diào)節(jié)正常T細胞表達和分泌因子 （regulated on activation normal T cell expressed and secreted，RANTES）是乳腺癌、卵巢癌以及宮頸癌等腫瘤淋巴細胞浸潤的主要趨化因子[1-2]。本文采用免疫組化和原位雜交技術(shù)對卵巢癌及良性腫瘤組織、卵巢良性疾病組織中RANTES的蛋白和mRNA表達進行研究，以探討RANTES在卵巢癌中的表達情況及其與臨床分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料來源

收集齊齊哈爾醫(yī)學院附屬醫(yī)院2000～2008年卵巢癌組織及卵巢癌盆腔腹膜轉(zhuǎn)移灶實施根治手術(shù)標本45例，上皮性良性腫瘤組17例，卵巢良性疾病組織20例。術(shù)前均未接受化療，患者平均年齡54歲（35～72歲），臨床資料完整，石蠟標本保存。

1.2 實驗方法

免疫組化檢測RANTES蛋白每例標本切取4 μm厚切片，試劑RANTES為鼠單克隆抗體，免疫組化試劑購自福州邁新生物技術(shù)公司，具體按常規(guī)SP法操作。免疫組化染色性反應應為黃至棕黃色顆粒，RANTES定位細胞漿，以細胞數(shù)＞10%為陽性標準，陽性強度分級：細胞數(shù)10%～25%為（+），25%～50%為（++），＞50%為（+++）。

原位雜交法檢測RANTES mRNA，按原位雜交法的要求對RANTES陽性的病例標本進行固定和石蠟包埋，切片至4～6 μm。石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水，過氧化物酶和胃蛋白酶處理后，加入預雜交液，40℃濕盒內(nèi)預雜交3 h，吸除預雜交液，加含有探針雜交液，42℃濕盒內(nèi)過夜，加生物素化鼠抗地高辛、SABC、生物素化過氧化物酶37℃濕盒內(nèi)各15 min，DAB顯色，中性樹膠封片。同時設空白對照組（不含探針）和陰性對照組（預先用RNA酶消化40 min）。陽性雜交結(jié)果可見胞漿著色呈棕紫藍色顆粒。按照陽性細胞比例≤10%為1分，10%～50%為2分，＞50%為3分；按染色強弱：陰性為0分；淡黃（藍）色染色為1分；中度黃（藍）色染色為2分，棕黃（紫藍）色染色為3分。

1.3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 10.0統(tǒng)計分析軟件處理所有數(shù)據(jù)，χ2檢驗比較率的差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 RANTES蛋白在不同卵巢組織中的表達

卵巢癌組織中RANTES蛋白的陽性表達位于癌細胞的細胞質(zhì)中，呈彌漫棕黃色顆粒，它們在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達同非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達相比，差異均有統(tǒng)計學意義，在正常卵巢組織中多呈陰性表達（表1）。

2.2 RANTES mRNA在不同卵巢組織中的表達

卵巢癌組織中RANTES mRNA的陽性表達位于癌細胞的細胞質(zhì)中，呈彌漫棕黃色顆粒，在正常卵巢組織中呈陰性表達；它們在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達同非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達相比，差異均有統(tǒng)計學意義（表1）。

2.3 卵巢癌中RANTES的表達與臨床病理特征的關(guān)系

在≥60歲和＜60歲卵巢癌患者中RANTES蛋白和mR NA的表達差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）。不同臨床分期的RANTES蛋白和mRNA的表達不同，晚期卵巢癌中RANTES蛋白和mRNA陽性表達率明顯增高。Ⅰ、Ⅱ期與Ⅲ、Ⅳ期的陽性表達率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 卵巢癌中RANTES蛋白及mRNA陽性表達與臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]Tab.1 The relationship between RANTES protein and mRNA positive expression and clinical pathological characteristic[n(%)]

3 討論

已證明很多因素參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，但不同組織來源的腫瘤細胞遷移到特定部位的分子機制還不清楚。趨化因子是一組結(jié)構(gòu)相關(guān)的小分子，具有調(diào)節(jié)各種類型的白細胞遷移、吸引具有特定趨化因子受體的炎癥細胞浸潤到炎癥部位參與炎癥反應的特點。在腫瘤細胞定向遷移的過程中，趨化因子通過與腫瘤細胞表面相應的受體相互作用，能誘導腫瘤細胞骨架重排，促使腫瘤細胞緊密黏附于淋巴管內(nèi)皮細胞，最終實現(xiàn)定向性遷移[3-4]。RANTES是一種由68個氨基酸組成的小蛋白，屬于快速增長CC類趨化因子家族，是趨化T細胞和單個核細胞的CC類趨化性細胞因子，也是一種腫瘤細胞表達的主要趨化性細胞因子，并與卵巢癌、子宮內(nèi)膜異位癥等疾病進展有關(guān)[5]。在腫瘤部位，RANTES通過募集并活化單個核細胞和腫瘤細胞導致MMP表達，RANTES促進血管生長可能與增加MMP9表達進而促進腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生有關(guān)。RANTES在乳腺癌、宮頸癌中可作為預后的評價指標[6]。卵巢癌患者血清中RANTES的異常升高與腫瘤的分期有關(guān)，隨著惡性程度的增加，血清RANTES含量增高[7]。Zhou等[8]研究發(fā)現(xiàn)，卵巢和子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞也同樣表達RANTES。本研究通過免疫組化方法，檢測到卵巢癌中有RANTES蛋白強陽性表達，其陽性表達率為80%，而在正常卵巢組織中無表達或表達較弱。研究發(fā)現(xiàn)，很多趨化因子可能參與了生理性、病理性淋巴管的形成和調(diào)節(jié)，并參與了腫瘤細胞的移動、歸巢和轉(zhuǎn)移的控制[9]。淋巴管的內(nèi)皮細胞通過分泌趨化因子趨化腫瘤細胞，進而促進腫瘤細胞的淋巴轉(zhuǎn)移[10]。本研究表明，在卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中RANTES也有強的陽性表達（85.71%），并且RANTES在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例中的表達顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。同時，在分析RANTES表達與臨床病理的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，RANTES的表達與腫瘤病理分級、TNM分期密切相關(guān)，而患病年齡無顯著差異。進一步通過原位雜交的方法檢測卵巢癌中RANTES mRNA的表達情況，結(jié)果顯示原位雜交與免疫組化結(jié)果基本一致，這一結(jié)果進一步支持了免疫組化的檢測結(jié)果。

本研究結(jié)果表明，RANTES在卵巢癌組織的高表達與卵巢癌的發(fā)展、侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示RANTES的表達在卵巢癌侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，RANTES有可能成為卵巢癌治療的新靶點。

[1]Balkw ill F,Mantovani A.Inflammation and cancer:back to Virchow[J]. Lancet,2001,357(9255):539-545.

[2]Vicari AP,Caux C.Chemokines in cancer[J].Cytokine Growth Factor Rev,2002,13(2):143-154.

[3]Mori T,Doi R,Koizumi M,et al.CXCR4 antagonist inhibits stromal cell-derived factor 1-induced migration and invasion of human pancreatic cancer[J].Mol Cancer Ther,2004,3(1):29-37.

[4]Salvucci O,Yao L,Villalba S,et al.Ragulation of endothelial cell branching morphogenesis by endogenous chemokine stromal-derived factor-1[J].Blood,2002,99(8):2703.

[5]Hornung D,Klingel K,Dohrn K,et al.Regulated on activation,normal T2cell-expressed and-secreted mRNA expression in normal endometrium and endometriotic implants:assessment of autocrine/paracrine regulation by in situ hybridization[J].Am J Pathol,2001,158(6):1949-1954.

[6]Niwa Y,Akamatsu H,Niwa H,et al.Correlation of tissue and plasma RANTES levels with disease course in patients with breast or cervical cancer[J].Clin CancerRes,2001,7(2):285-289.

[7]祁建青,蔡惠萍,杜鴻,等.卵巢癌患者血清中RANTES的濃度水平及其臨床意義[J].中國腫瘤臨床與康復,2006,13(6):491-493.

[8]Zhou C,Borillo J,Wu J.Ovarian expression of chemokines and their receptors[J].J Reprod Immuno,2004,63(1):1-9.

[9]Murphy PM.Chemokines and the molecular basis of cancer metastasis[J]. N Engl J Med,2001,345(11):833-835.

[10]Baggiolini M.Chemokines and leukocyte traffic [J].Nature,1998,392 (6676):565-568.

Expression and their biological significances of RANTES proteins and mRNA in human ovarian carcinoma

ZHENG Lihong,CHEN Ping,MEI Qingbu,LIU Feng,WU Nan
(Qiqihar Medical College,Heilongjiang Province,Qiqihar 161006,China)

[Absrtact]Objective:To study the expression of regulated on activation,normal T cell expressed and secreted(RANTES) protein and mRNA in human ovarian carcinoma(OC),evaluate the relationship between the expression of RANTES protein and the clinic pathology factors,and lymph node metastasis of OC and to analyze the clinical significance.Methods:Expression of RANTES was examined by immunohistochemistry in benign ovarian tumors and malignant ovarian carcinoma. The expression of RANTES and mRNA in these specimens were detected by in-situ hybridization.The relationship between expression and biologic characteristic of ovarian carcinoma was analyzed.Results:The positive expression of RANTES protein in ovarian carcinoma was higher than that in benign ovarian tumors,there was a significant statistic difference between two groups(P＜0.05).The expression rate of RANTES protein was closely correlated with the histological grade, lymphatic metastasis and TNM grade in ovarian carcinoma(P＜0.05).The expression rates of RANTES mRNA in ovarian carcinoma and benign ovarian tumors were 75.55%,11.76%respectively,there was a significant statistic difference between two groups(P＜0.05).The expression rate of RANTES mRNA was closely correlated with the histological grade and TNM grade in ovarian carcinoma(P＜0.05).Conclusion:Higher expression of RANTES may be related to development,invasion and metastasis of ovarian carcinoma.

Ovarian carcinoma;RANTES;In-situ hybridization;Immunohistochemistry

R737.31

A

1673-7210（2011）02（c）-024-02

黑龍江省教育廳科學技術(shù)研究項目（項目名稱：卵巢癌腹膜轉(zhuǎn)移趨化因子作用的研究；項目編號：11541414）。

2010-12-16）