劉 嘉，梁新華，焦 炎

（山西醫(yī)科大學法醫(yī)學院，山西太原 030001）

小鼠胃和闌尾組織中h-CD降解規(guī)律與死亡時間的相關(guān)性研究

劉 嘉，梁新華，焦 炎

（山西醫(yī)科大學法醫(yī)學院，山西太原 030001）

目的：觀察小鼠死亡后不同時間胃和闌尾組織中h-CD含量的變化，探討不同溫度條件下h-CD的降解規(guī)律與死亡時間的關(guān)系及其組織差異性。方法：選取72只健康成年昆明小鼠，采用機械性窒息致死后，隨機分為兩組，分別置于4℃冰箱和25℃人工氣候箱中，并于死后0、24、48、72、96、120 h提取胃及闌尾組織，采用免疫印記及計算機圖像分析技術(shù)檢測上述組織中h-CD的含量，應(yīng)用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果：①h-CD的含量隨死亡時間的延長而降低，與死亡時間具有相關(guān)性；②不同溫度條件下，胃和闌尾組織中h-CD的降解速度均存在明顯差異（P＜0.05），h-CD在25℃組降解速度快于4℃組（P＜0.05）；③h-CD的降解速度在胃和闌尾組織中存在組織差異性，在闌尾組織中的降解速度較快（P＜0.05）。結(jié)論：h-CD的含量隨死亡時間延長而降低，其降解速度受環(huán)境溫度影響，溫度升高，降解速度加快，且胃和闌尾組織中h-CD的降解速度具有組織差異性，其在闌尾組織中的降解速度快于胃組織中的降解速度。

法醫(yī)病理學；重型鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白；死亡時間；免疫印記

機體死亡后，發(fā)揮重要生命功能的蛋白質(zhì)也會隨之發(fā)生降解。蛋白質(zhì)的降解不僅受蛋白酶的作用，而且受尸體所處環(huán)境溫度的影響[1]。本實驗應(yīng)用免疫印記法，觀察小鼠死亡后不同溫度條件下胃和闌尾組織中重型鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白（h-CD）的降解規(guī)律，為死亡時間的推斷提供有效的法醫(yī)學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及制備

本研究選用實驗動物已獲得本校倫理委員會的同意。選取72只健康成年昆明小鼠，雌雄不限，體重（30±5）g（由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供）。采用機械性窒息方式致死后隨機分為低溫組和高溫組，每組36只，分別放置于4℃冰箱和25℃人工氣候箱中，再依據(jù)死亡時間將兩組分別再分為對照組、死后 24、48、72、96、120 h 組 6 個亞組，每組 6 只。

1.2 免疫印記檢測

分別稱取100 mg胃和闌尾組織，加入1 ml裂解液（RIAP）和10 μmol/L蛋白酶抑制劑（PMSF）。加入適量液氮，在研缽中充分研磨。 將組織勻漿后抽取500 μl，4℃ 12 000×g離心30 min，移取上清液測蛋白濃度后置于-80℃冰箱中備用。取20 μg蛋白樣品，在10%變性聚丙烯酰胺凝膠中垂直板電泳，80 V，20 min濃縮膠，120 V，70 min分離膠。用水平電泳槽將凝膠進行電轉(zhuǎn)移100 V，50 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（購自武漢博士德生物工程有限公司）上。將含有蛋白質(zhì)的硝酸纖維膜用TBST脫脂奶粉封閉，平緩搖動過夜，按1∶300加入caldesmon單克隆抗體（購自武漢博士德生物工程有限公司），室溫下 1 h，TBST 洗膜 10 min×3 次，按 1∶400 分別加入二抗，室溫下1 h，TBST洗膜10 min×3次。然后分別加入等體積發(fā)光劑（購自北京普利來基因有限公司）和增強劑反應(yīng)1 min，分別對二者進行檢測后，柯達（KODAK Image station 440）全自動顯影系統(tǒng)顯像。免疫印跡法結(jié)果進行圖像掃描后采用Image proplus 5.0測出各條帶的積分光密度值（integrate optical density，IOD）。 實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示。應(yīng)用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

Western-blot檢測可見，存放于4℃和25℃溫度條件下的小鼠胃、闌尾組織中的h-CD的含量均隨死亡時間的延長而逐漸減少（圖1、2），且變化趨勢表現(xiàn)出一定的規(guī)律性，四組條帶顏色均隨死亡時間的延長而逐漸變淺，同一時間點處，25℃條件下，胃和闌尾中h-CD的含量明顯少于4℃條件時h-CD的含量，而在溫度相同的條件下可見，h-CD在闌尾組織中的降解速度快于其在胃組織中的速度。

IOD值分析結(jié)果顯示：在α=0.05檢驗水準下，4℃條件時，對胃組織在各時間點時h-CD的含量與相鄰上一時間點時 h-CD的含量進行檢驗，t值依次 為 45.205、57.429、62.799、110.229、78.282，可得 P 值均小于 0.05，具有統(tǒng)計學意義；對闌尾組織進行相同的檢驗，t值依次為43.171、51.382、275.094、121.302、60.061，P 均<0.05， 差異具有統(tǒng)計學意義。25℃條件時，對胃組織進行相同檢驗，t值依次為9.132、15.684、59.941、63.392、51.878，P 均<0.05， 差異有統(tǒng)計學意義；對闌尾組織進行相同的檢驗，t值依次為115.429、187.980、178.497、83.328、55.579，P 均<0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。由上述分析可知，各組中h-CD的含量均隨時間的延長而減少。見表1。各時間點h-CD含量的相對變化以死后不同時間點h-CD含量占死亡即刻含量的百分數(shù)來反應(yīng)，在α=0.05檢驗水準下，4℃條件時，對胃和闌尾組織中h-CD含量百分數(shù)進行檢驗，t值依次為 6.231、13.115、70.779、65.209、31.674，P均<0.05，差異具有統(tǒng)計學意義；在25℃條件時檢驗 ，t 值 依 次 為 4.430、45.632、62.525、47.156、22.517，P 均 <0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。對胃組織4℃組和25℃組的數(shù)據(jù)進行檢驗，t值依次為 1.173、30.356、77.813、105.650、85.777，可知除死后24 h 4℃組和25℃組數(shù)據(jù)無統(tǒng)計學意義 （P=0.294）外，其余P均<0.05，差異具有統(tǒng)計學意義；對闌尾組織中各數(shù)據(jù)進行上述檢驗，t值依次為15.570、210.634、85.413、137.843、126.440，P 均<0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。分析數(shù)據(jù)可知25℃組胃和闌尾組織h-CD降解速度均高于4℃組，且在同溫度比較中闌尾組織中h-CD降解速度均高于胃組織的降解速度。見表2。

表1 小鼠死后不同時間不同溫度h-CD的IOD值（±s）Tab.1 The IOD values of h-CD of mouse in the different time and temperature(±s)

表1 小鼠死后不同時間不同溫度h-CD的IOD值（±s）Tab.1 The IOD values of h-CD of mouse in the different time and temperature(±s)

與上鄰組比較，#P＜0.05Compared with up group in the same temperature and tissue,#P＜0.05

時間（h）4℃胃闌尾25℃胃闌尾0 24 48 72 96 120 14 711.23±129.35 12 095.50±16.18#9229.50±110.68#6 509.00±17.94#4 074.50±54.44#2 046.50±30.79#14 711.23±129.35 12 095.50±16.18#9 229.50±110.68#6 509.00±17.94#4 074.50±54.44#2 046.50±30.79#14 656.00±93.52 11 627.33±750.98#7 169.83±104.94#3 965.67±60.52#1 969.17±38.06#942.50±14.07#13 903.17±37.56 9 717.00±68.97#3 914.83±25.85#2 218.17±30.73#1 262.17±4.02#672.33±22.34#

表2 小鼠死后不同時間段h-CD含量的相對變化（±s，%）Tab.2 The relative content changes of h-CD of mouse in different time and temperature(±s,%)

表2 小鼠死后不同時間段h-CD含量的相對變化（±s，%）Tab.2 The relative content changes of h-CD of mouse in different time and temperature(±s,%)

同溫度不同組織間比較，*P＜0.05；同組織不同溫度間比較，#P＜0.05Comparedwithdifferent tissuesinthe same temperature,*P＜0.05;compared with different temperature in the same tissue,#P＜0.05

時間（h）4℃胃闌尾25℃胃闌尾0 24 48 72 96 120 100 82.2%±0.8 62.7%±0.6 44.3%±0.4 27.7%±0.4 13.9%±0.2 100%78.6%±1.2*58.6%±0.2*29.5%±0.2*17.4%±0.2*12.2%±0.1*100%79.3%±5.5 48.9%±1.0#27.0%±0.4#13.4%±0.3#6.3%±0.1#100%69.9%±0.6*#28.2%±0.2*#15.9%±0.2*#9.1%±0.1*#4.8%±0.2*#

3 討論

h-CD存在于正常平滑肌細胞和軟組織平滑肌腫瘤[2]及多種骨腫瘤中[3]，它可以起到抑制肌球蛋白Mg-ATP酶活性的作用，還可以抑制平滑肌磷酸化肌球蛋白所引發(fā)的肌動蛋白絲的移動[4-6]，是一種重要的調(diào)節(jié)蛋白。有研究表明，機體死亡后96 h內(nèi)h-CD的含量仍保持相對穩(wěn)定[7]，因此可選其作為早期死亡時間推斷的測量指標。

從本實驗可以看出在胃和闌尾組織中h-CD的含量隨死亡時間的延長而降低，與死亡時間具有相關(guān)性；在不同溫度條件下，h-CD 的含量變化存在差異（P＜0.05），h-CD 在25℃組中的降解速度快于4℃組；且h-CD的降解速度在胃和闌尾組織中也存在差異（P＜0.05），在闌尾組織中的降解速度較快。這主要是由于在機體死亡后，由于細胞膜滲透能力的變化，使得離子能自由的出入細胞。從細胞外環(huán)境、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、肌質(zhì)網(wǎng)釋放出來的游離Ca2+進入了細胞液是死后發(fā)生細胞或分子水平發(fā)生變化的重要原因之一[8-9]。Ca2+進入細胞引起一系列后果：①激活鈣調(diào)蛋白。隨著死亡時間的逐漸延長，大量鈣調(diào)蛋白被進入細胞液的游離Ca2+激活，從而使作為靶蛋白的鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白由于與被活化的鈣調(diào)蛋白結(jié)合[10]，其含量則逐漸下降。②激活依賴Ca2+的蛋白激酶，例如鈣蛋白酶[11]，它作用于鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白后，可以根據(jù)酶解物的特異性確定鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白的亞型。由于死后大量的鈣蛋白酶被激活，導致大量的鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白被酶解，因此在一定時間內(nèi)，隨著死亡時間的延長，由于依賴Ca2+的蛋白激酶被大量活化，鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白的含量逐漸下降。以上說明，死后細胞液游離Ca2+的增加導致了鈣調(diào)蛋白和依賴Ca2+的蛋白激酶的激活，最終引起h-CD發(fā)生降解而含量減少，且隨著死亡時間的延長，機體組織的pH值逐漸降低[12]，鈣蛋白酶活性下降而溶酶體釋放的蛋白水解酶（最適pH值3～7）活性增強[13]。由于鈣蛋白酶和死亡后期溶酶體釋放的蛋白水解酶的激活，使得鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白發(fā)生了蛋白水解作用而降解。因此在本實驗中，通過免疫印記法檢測可以看到隨著時間的延長，h-CD的含量逐漸降低。

在4℃組和25℃組的比較中還可發(fā)現(xiàn)，高溫組中h-CD的降解程度高于低溫組，這說明高溫可以加快蛋白質(zhì)的分解而低溫則可起到延遲分解的作用[14-15]。這主要是因為機體死后，組織、細胞的自溶主要是在其自身固有的各種酶的作用下進行的，而酶活性的高低很大程度上受溫度的調(diào)控。因此在高溫環(huán)境下，組織、細胞結(jié)構(gòu)破壞、溶解要早于低溫環(huán)境。在相同溫度條件下，腸組織自溶發(fā)生早于胃組織，其中以回盲部附近為最早，而胃體部自溶較晚[16]。從本實驗也可發(fā)現(xiàn)，在同組比較中，h-CD在闌尾組織中的降解速度快于在胃組織的降解速度，這與尸體腐敗的一般順序相一致。此外，影響蛋白質(zhì)分解的另一重要因素是腐敗菌的作用。由于其在胃中分布很少，故而在相同溫度條件下，闌尾組織中h-CD降解速度更快。以上的實驗結(jié)果證實了h-CD的講解規(guī)律與死亡時間及溫度存在有相關(guān)性；但由于人與動物間存在種屬差異以及h-CD降解過程中受多重內(nèi)、外因的影響，因此要明確h-CD在人體中的降解規(guī)律則有待于今后大量人體實驗的研究。此研究成果將對法醫(yī)學鑒定中死亡時間的認定有很大幫助。

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Associativity study between h-CD degradation regularity and the estimation of postmortem interval in stomach and appendix of mice

LIU Jia,LIANG Xinhua,JIAO Yan
(Faculty of Forensic Medicine of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China)

Objective:To observe the postmortem degradation of high molecular-weight caldesmon(h-CD)in stomach and appendix smooth muscle cells of mice,study the effects of postmortem intervals,and ambient temperature on the h-CD degradation of mice,and the variability of the h-CD degradation in stomach smooth muscle cells and appendix smooth muscle cells in different ambient temperature.Methods:72 healthy adult Kunming mice were killed by asphyxia,and put them in 4℃ refrigerator and 25℃ artificial climate incubator respectively,then extractd the stomach and appendix tissues at 0,24,48,72,96,120 h after dead.The h-CD contents in the above tissues were quantitated by western-blot assay and collected by Image Pro Plus 5.0 image analysis system,then the datas were statistically analyzed with the SPSS 16.0 software.Results:①h-CD content in stomach and appendix tissues decreased with the postmortem intervals,there was correlation between the postmortem degradation of h-CD and the postmortem intervals;②The differences of the postmortem degradation of h-CD in different ambient temperature were significant(P＜0.05),the degradation in 25℃ faster than that in 4℃;③The differences of the postmortem degradation of h-CD between stomach and appendix tissues were significant(P＜0.05),the degradation in the appendix more faster.Conclusion:h-CD content in stomach and appendix tissues decreased gradually with the postmortem intervals,the postmortem degradation of h-CD is influenced by ambient temperature,and the degradation rate tends to be raised with higher temperature,and the differences of the postmortem degradation of h-CD between stomach and appendix tissues are significant,the degradation in the appendix more faster.

Forensic pathology;High molecular-weight caldesmon(h-CD);Postmortem intervals(PMI);Western-blot

D919.4

A

1673-7210（2011）02（c）-017-03

2010-12-16）