熊 婧，白 楊

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東廣州510515

噬菌體是特異性感染細(xì)菌的一類原核生物病毒，分別由Towort和Herelle在20世紀(jì)初從葡萄球菌和志賀菌中首先發(fā)現(xiàn)。噬菌體可分為毒性噬菌體和溫和噬菌體兩大類。毒性噬菌體感染宿主菌后，能在宿主菌細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立復(fù)制增殖，產(chǎn)生多個(gè)子代噬菌體，并最終裂解細(xì)菌。溫和噬菌體則將其基因組整合至宿主菌染色體中，不獨(dú)立復(fù)制，隨細(xì)菌的分裂而傳代，不裂解細(xì)菌。因此可利用毒性噬菌體治療細(xì)菌感染。早在1919年噬菌體剛發(fā)現(xiàn)不久，東歐和前蘇聯(lián)便開始運(yùn)用噬菌體來治療細(xì)菌感染，但二戰(zhàn)后抗生素的廣泛使用及不純的噬菌體制劑細(xì)菌抗原的存在會(huì)引起免疫反應(yīng)等因素阻礙了西方國家對噬菌體治療疾病的研究。

幽門螺桿菌(H．pylori)是臨床重要致病因子，已經(jīng)確認(rèn)H．pylori與胃腸道疾病中的慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌和胃黏膜相關(guān)淋巴組織(MALT)淋巴瘤4種疾病關(guān)系密切［1］。H．pylori呈世界范圍分布，約有50%的人感染。根治H．pylori能有效治愈潰瘍、預(yù)防胃癌等。目前尚無單一藥物可根治H．pylori感染，臨床上主要以質(zhì)子泵抑制劑(PPI)加克拉霉素再加阿莫西林或甲硝唑的三聯(lián)治療方案根除率最高，可達(dá)80%～90%;但近些年，由于H．pylori對抗生素耐藥性的產(chǎn)生，主要是對甲硝唑和克拉霉素的耐藥，導(dǎo)致根除率下降至70% ～80%［2-9］。因此，尋找新的方法替代抗生素治療H．pylori感染是非常必要的，而噬菌體在這方面有著極大的潛力。

1 幽門螺桿菌耐藥的一般情況

1．1 隨地區(qū)分布而不同 不同國家甚至同一國家不同地區(qū)由于當(dāng)?shù)亓?xí)慣使用的抗生素不同導(dǎo)致H．pylori對各種抗生素耐藥率不同。一般來說，發(fā)展中國家耐藥情況比發(fā)達(dá)國家嚴(yán)重。繼發(fā)耐藥也比原發(fā)耐藥嚴(yán)重。抗H．pylori的抗生素常用于其他系統(tǒng)疾病而導(dǎo)致普遍耐藥。如甲硝唑常用于寄生蟲疾病、婦科和牙科感染;克拉霉素常用于呼吸系統(tǒng)感染;阿莫西林常用于鏈球菌咽炎和泌尿系統(tǒng)感染;四環(huán)素常用于呼吸系統(tǒng)、腸道疾病及預(yù)防旅行者腹瀉和霍亂;呋喃唑酮用于治療賈第鞭毛蟲病。我國于2005年對19個(gè)省市H．pylori耐藥流行病學(xué)調(diào)查［10］表明不同地區(qū)甲硝唑耐藥率存在較大差異，其耐藥率為 50% ～100%(平均73.3%)、克拉霉素0～40%(平均23.9%)、阿莫西林0～2.7%。2007年張虹雨等［11］對昆明地區(qū)70例H．pylori陽性胃黏膜標(biāo)本研究發(fā)現(xiàn)H．pylori對克拉霉素耐藥率11.4%(8/70)，甲硝唑耐藥率為77.1%(54/ 70)，阿莫西耐藥率為0。2009年宋紅蕾等［12］從蘇州地區(qū)141例消化性潰瘍患者中分離出并成功傳代56株H．pylori，發(fā)現(xiàn)甲硝唑的耐藥率為42.9%，克拉霉素耐藥率為16.1%。2010年蔡躍芳等［13］發(fā)現(xiàn)東莞市H．pylori甲硝唑耐藥率高達(dá)89.5%(68/76)，克拉霉素為27.6%(21/76)，阿莫西林為6.6%(5/76)，呋喃唑酮為13.2%(10/76)。2010年Janssen等［14］對荷蘭1997年～2002年1 355例患者研究發(fā)現(xiàn)甲硝唑和克拉霉素原發(fā)耐藥率分別為14.4%、1.0%，繼發(fā)耐藥率分別為43%、5.3%(繼發(fā)耐藥比原發(fā)耐藥嚴(yán)重)。一項(xiàng)對西班牙101例兒童研究［15］發(fā)現(xiàn)H．pylori對甲硝唑、克拉霉素耐藥率分別為35.7%、54.6%。在伊朗［16］，2005年～2008年克拉霉素、阿莫西林、呋喃唑酮耐藥率分別為7.3%、7.3%、4.5%。

1．2 隨時(shí)間發(fā)展而增加 韓國首爾［17］歷時(shí)16年的研究發(fā)現(xiàn)，1987年H．pylori對克拉霉素的耐藥率為0，1994年上升至2.8%，2003年則達(dá)到13.8%。烏拉圭Torres-Debat等［18］對2001年和2006年50例患者的研究發(fā)現(xiàn)，H．pylori對克拉霉素耐藥率平均為12%，2006年為 19%，而 2001年為 0。在意大利，De Francesco等［19］對1989年～1990年147例患者分析發(fā)現(xiàn)克拉霉素耐藥率為10.2%，而2004年～2005年則升至21.3%。

2 噬菌體治療耐藥性幽門螺桿菌的研究

2．1 噬菌體展示技術(shù) 1985年Smith［20］首次建立噬菌體展示技術(shù)。它是一種將外源肽或蛋白與特定噬菌體衣殼蛋白融合并展示于噬菌體表面的技術(shù)。它將外源基因插入到噬菌體展示載體上信號(hào)肽基因和衣殼蛋白編碼基因之間，從而使外源基因編碼的多肽或蛋白質(zhì)與外殼蛋白以融合蛋白形式展示在噬菌體表面，被展示的外源肽或蛋白可保持相對獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性。其主要特點(diǎn)是將特定分子的基因型和表型統(tǒng)一在同一噬菌體內(nèi)。常用的噬菌體展示系統(tǒng)有絲狀噬菌體系統(tǒng)、T4和T7噬菌體系統(tǒng)、λ噬菌體系統(tǒng)等。

2．1．1 噬菌體展示技術(shù)在H．pylori疫苗研究方面的作用:王克霞等［21］以幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白(CagA)基因片段作為固相篩選分子，對噬菌體人胃細(xì)胞cDNA文庫進(jìn)行富集，篩選出陽性克隆后構(gòu)建克隆載體，得到了幽門螺桿菌CagA基因共編碼核纖層蛋白B1和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2兩種已知蛋白，為研究CagA致病機(jī)理及研制幽門螺桿菌疫苗等提供依據(jù)?？寺”磉_(dá)幽門螺桿菌基因hp0410，構(gòu)建12肽噬菌體展示庫，對hp0410的抗原表位進(jìn)行篩選和分析，獲得8個(gè)hp0410高抗原性區(qū)域的模擬表位，其中1個(gè)為模擬單抗E018特異性結(jié)合的抗原決定基的候選表位，為構(gòu)建多表位嵌合疫苗提供了理論依據(jù)［22］。Li等［23］通過PCR獲取H．pylori的外膜蛋白Lpp20，并作為免疫原由雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生單克隆抗體，使用單克隆抗體來篩選噬菌體展示庫，發(fā)現(xiàn)一個(gè)模擬表位在114～117氨基酸位置與Lpp20蛋白抗體良好結(jié)合，Lpp20模擬表位可用于H．pylori疫苗的開發(fā)。Houimel等［24］利用噬菌體抗體庫篩選出了幽門螺桿菌尿素酶的人源單鏈抗體，并從肽庫中篩選出與尿毒酶單鏈抗體相結(jié)合的6肽，這種6肽作為一種模擬表位，可用于研制幽門螺桿菌疫苗。

2．1．2 噬菌體展示技術(shù)在H．pylori單鏈抗體研究方面的作用:Krishnaswamy等［25］用白色念珠菌HM-1殺傷毒素單抗免疫小鼠后構(gòu)建了scFv抗體庫，通過競爭篩選得到1株scFv-C1陽性噬菌體抗體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示該單抗不僅可模擬中和HM-1殺傷毒素單抗在體內(nèi)的抗真菌活性，并且比該單抗對其抗原特異性結(jié)合的親和性高出260倍。國內(nèi)紀(jì)卿等［26］首次用H．pylori完整細(xì)胞通過噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行單鏈抗體的篩選，最終得到1株特異性表達(dá)抗H．pylori的ScFv的噬菌體JH1，為H．pylori單鏈抗體研究提供了新思路。

2．2 H．pylori噬菌體 噬菌體與宿主菌關(guān)系具有高度特異性，即一種噬菌體只能寄生與裂解一種與之對應(yīng)的細(xì)菌。1990年Schmid等［27］首次正式報(bào)道在一株臨床分離的H．pylori菌株(SchReck 290)中發(fā)現(xiàn)了自發(fā)產(chǎn)生的不同生長階段的H．pylori噬菌體。在電鏡下該成熟噬菌體的頭部大小約70 nm×60 nm，尾部長至少120 nm。3年后Heintschel von Heinegg等［28］在另一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)H．pylori噬菌體能感染10株不同H．pylori菌株中的2種，并且證實(shí)其遺傳物質(zhì)是含有22 000個(gè)堿基對dsDNA。

2．3 噬菌體治療耐藥H．pylori展望 大量證據(jù)證明噬菌體具有有效的殺菌作用及臨床療效。Gupta等［29］報(bào)道了多價(jià)噬菌體P～27/HP可控制人類多重耐藥葡萄球菌屬的感染。該噬菌體可抑制60%與人類疾病相關(guān)的葡萄球菌生長。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，皮下單獨(dú)注射該噬菌體能有效保護(hù)葡萄球菌P～27/HP感染的小鼠免于死亡。Kumari等［30］有關(guān)噬菌體Kpn5治療感染肺炎克雷白桿菌的燒傷小鼠的研究報(bào)道也證實(shí)了這一點(diǎn)。Cerca等［31］研究報(bào)道在使用多價(jià)抗葡萄球菌噬菌體K 24 h后仍可以有效減少表皮葡萄球菌生物膜的生物量。未來噬菌體有望通過以下幾種途徑治療耐藥H．pylori:①噬菌體抗菌劑。噬菌體本身具有殺菌活性，但噬菌體具有高度特異性，即使同一種細(xì)菌不同菌株，噬菌體也不同。因此篩選廣譜噬菌體治療H．pylori感染是今后研究的主要方向。② 利用噬菌體自身裂解酶。噬菌體對細(xì)菌破壞作用是通過裂解酶。③噬菌體作為抗菌藥物治療載體。直接將抗菌藥物連接至噬菌體上，提高抗生素局部濃度來殺死耐藥菌株的目的，或利用噬菌體將外源性致死性基因帶入細(xì)菌內(nèi)并表達(dá)成殺菌蛋白，在細(xì)胞內(nèi)部殺死細(xì)菌［32］。

H．pylori敏感的抗生素并不多，一線治療藥物耐藥菌株出現(xiàn)致根除率下降后人們常使用其他抗生素如呋喃唑酮、左氧氟沙星等替代，如今同樣已有耐藥菌株出現(xiàn)［33-34］。盡管仍可以開發(fā)新的靶點(diǎn)不同抗生素，但隨著新抗生素使用，仍會(huì)有新耐藥菌株的出現(xiàn)。而噬菌體制劑具有殺菌力強(qiáng)大、宿主特異性強(qiáng)、研制速度快等特點(diǎn)，使其在治療H．pylori方面具有顯著優(yōu)勢，有望在不久的將來成為治療H．pylori的重要組成部分。

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