陳國梁，陳宗禮，齊向英，賀曉龍

（陜西省延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心，716000）

馬鈴薯塊莖組織特異性啟動子GBSS的克隆及序列分析

陳國梁，陳宗禮，齊向英，賀曉龍

（陜西省延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心，716000）

利用PCR技術(shù)從馬鈴薯隴薯3號基因組DNA中擴(kuò)增出長度約為600 bp的DNA片段，經(jīng)與T載體連接，測序表明，克隆到的DNA片段大小為599 bp，該序列與Genebank中已公布的GBSS啟動子序列同源性為99.67%；采用植物順式調(diào)控元件數(shù)據(jù)庫PLACE和PlantCare對其進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明，該片段含有啟動子的保守序列TATA-box和CAAT-box。此外，還具有諸如TAACAAA、CTAACAC、CTCTT及CACT等序列，而這些特異序列可能是基因特異表達(dá)所必須的。

馬鈴薯；組織特異性；啟動子；PCR

隨著基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展及日趨成熟，該技術(shù)在植物遺傳育種及性狀改良等應(yīng)用方面日益顯示出極高的價值。啟動子基因工程載體的主要構(gòu)成原件，是調(diào)控基因表達(dá)的“開關(guān)”，對外源基因的表達(dá)水平影響很大，無論是基礎(chǔ)研究還是應(yīng)用研究，人們都希望能夠充分利用啟動子來準(zhǔn)確控制外源基因在植物體內(nèi)的表達(dá)[1～4]。組織特異性啟動子又稱為器官特異性啟動子，在該啟動子調(diào)控下，外源基因的表達(dá)一般只發(fā)生在某些特定的器官或組織部位，并往往表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。其最大的優(yōu)點(diǎn)是它所啟動的外源基因在受體中僅在需要的部位特異表達(dá)，從而克服了組成型啟動子啟動的外源基因在受體植物中非特異、持續(xù)、高效表達(dá)所造成的浪費(fèi)，增加轉(zhuǎn)基因的效果[5]，因此人們對特異性啟動子的研究和應(yīng)用越來越重視[5～8]。基于此，該研究開展了馬鈴薯塊莖組織特異性啟動子GBSS的克隆及序列分析，為下一步實(shí)現(xiàn)外源目的基因在馬鈴薯塊莖中的特異表達(dá)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

隴薯3號馬鈴薯試管苗，由延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。試劑pEGM-T vector購買于北京澤平科技有限責(zé)任公司。限制性內(nèi)切酶、連接酶、Taq酶均購自上海生物工程公司；寡核苷酸引物由上海生工生物技術(shù)公司合成；其他生化試劑和常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

①馬鈴薯總DNA的提取 取馬鈴薯試管苗葉片，采用CTAB法[9]提取馬鈴薯總DNA。

②目的片段的擴(kuò)增 在Genebank中查找已公布的馬鈴薯塊莖patatin啟動子序列并利用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物命名為G1（5'GTG GAA CGG AGA CAT GTT ATG A 3'）、G2（5'CGC ATG AAA TCA GAA ATA ATT GG 3'）；以所提取的DNA為模板，G1、G2作引物，在25 μL的反應(yīng)體系（含Taq酶緩沖液、dNTP、Taq酶）中，95℃5 min、95℃ 40 s、54℃ 50 s、72℃ 60 s擴(kuò)增 30個循環(huán)，72℃保溫10 min。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，將擴(kuò)增的單一條帶進(jìn)行回收。

③PCR產(chǎn)物與T載體的連接及鑒定 取上述PCR回收產(chǎn)物與T載體連接，采用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，將經(jīng)PCR鑒定的陽性質(zhì)粒DNA用SacⅠ、XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，將所得陽性重組子命名為pGEM-TG，并送往上海生物工程公司測序。

④序列分析 序列同源性分析采用DNAman軟件完成，啟動子序列調(diào)控元件分析利用植物順勢調(diào)控元件數(shù)據(jù)庫PLACE[10]和PlantCare[11]完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段的擴(kuò)增結(jié)果

以馬鈴薯總DNA為模板擴(kuò)增所得產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到大小約為600 bp的DNA片段（圖1），條帶單一、整齊、明亮。

2.2 重組質(zhì)粒的PCR檢測及酶切鑒定

以初步篩選出來的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增及經(jīng)SacⅠ/XhoⅠ雙酶切后電泳檢測，均獲得大小約為600 bp的單一明亮條帶（圖2），片段大小與預(yù)期一致，表明外源DNA片段已經(jīng)連接到T載體上。

2.3 測序結(jié)果

將所克隆的馬鈴薯啟動子與Genebank中的馬鈴薯GBSS啟動子序列進(jìn)行對比分析表明 （圖3），克隆到的序列大小為599 bp，與Genebank中已公布GBSS啟動子序列的同源性為99.67%，說明GBSS啟動子區(qū)序列呈現(xiàn)高度保守。

3 小結(jié)與討論

我們所克隆的馬鈴薯塊莖組織特異性啟動子大小為 599 bp，片段內(nèi) AT堿基含量較高，占59.6%。采用PLACE及PlantCare在線數(shù)據(jù)庫對其進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果顯示（圖3）：整個序列共有5個CAAT-box，分別在54，119，145，486 bp及578 bp處出現(xiàn)。CAAT-box一般決定著啟動子的起始頻率，5個CAAT-box表明該序列可能有較高的啟動頻率。561 bp處有TATA-box（TTTTA），其功能是保證轉(zhuǎn)錄得以精確起始；在207 bp及461 bp處分別有AT1-motif和12 bp回文序列，為馬鈴薯塊莖光效應(yīng)的順式作用元件；在69 bp處有淀粉酶基因5'-上游保守序列（TAACAAA）；在239 bp處有種子儲藏蛋白基因啟動子核心序列（CTAACAC）；457 bp處有CTCTT結(jié)構(gòu)，該序列具有根瘤細(xì)胞組織特異啟動活性保守序列；515～535 bp處有6個CACT磷酸烯醇丙酮酸羧基酶基因順式調(diào)控元件。以上序列分析表明，克隆的片段不僅具有完整的啟動子表達(dá)調(diào)控元件，還具有可能與組織特異性相關(guān)的特異序列（如TAACAAA、CTAACAC、CTCTT及CACT等序列），而這些特異序列可能是基因特異表達(dá)所必須的[10～12]。

圖1 目的片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖2 重組質(zhì)粒pGEM-TG的酶切與PCR鑒定

圖3 馬鈴薯GBSS啟動子序列分析

在植物基因工程研究中，利用組織特異性啟動子不僅能使目的基因的表達(dá)產(chǎn)物在一定器官或組織部位積累，增加區(qū)域表達(dá)量，同時也可以避免植物營養(yǎng)的不必要浪費(fèi)，并表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。Iglesias A A等[13]試驗(yàn)表明，將組成型表達(dá)的花椰菜花葉病毒啟動子和大腸桿菌ADPG焦磷酸化酶（AGPP）的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入馬鈴薯植株中，淀粉的顆粒形態(tài)發(fā)生了變化，顯微鏡下可以看到淀粉顆粒出現(xiàn)了裂痕，但在馬鈴薯塊莖特異表達(dá)啟動子patatin的控制下，淀粉形態(tài)卻沒有發(fā)生任何改變。而對馬鈴薯品質(zhì)的改良，歸根結(jié)底是對貯藏器官——塊莖中的基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，因此，我們已經(jīng)克隆到的patatin基因啟動子及本次克隆到的GBSS啟動子，將作為一種重要的順式作用元件，為其在馬鈴薯品質(zhì)改良的基因工程研究中進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

[1]李姍姍，遲彥，李凌飛，等.啟動子克隆方法研究進(jìn)展[J].中國生物工程雜志，2005，25（7）：9-16.

[2]夏江東，夏平.高等植物啟動子功能和結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展[J].楚雄師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，20（3）：41-48，52.

[3]于翠梅，馬蓮菊，張寶石.特異性啟動子在植物基因工程中的應(yīng)用[J].生物工程學(xué)報(bào)，2006，22（6）：882-890.

[4]宋揚(yáng)，周軍會，張永強(qiáng).植物組織特異性啟動子研究[J].生物技術(shù)通報(bào)，2007（6）：21-24.

[5]王淼，王旭靜，唐巧玲，等.高等植物綠色組織特異表達(dá)啟動子研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2010，12（2）：33-37.

[6]李翠，謝華，徐勇，等.桃PpMADS1基因啟動子的克隆及功能分析[J].中國生物工程雜志，2010，30（5）：57-62.

[7]林元震，張志毅，郭海，等.楊樹葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH）基因啟動子的克隆與分析[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2009，28（3）：445-449.

[8]王靜澄，李昊，崔東清，等.毛白楊PtSEP3-1基因啟動子的克隆分析及其表達(dá)載體構(gòu)建[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2010，29（2）：239-244.

[9]J.莎姆布魯克著.黃培堂譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].北京：科學(xué)出版社，1992.

[10]http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html[DB/OL].

[11]http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html[DB/ OL].

[12]Liu X J,Prat S,Willmitzer L,et al.Cis regulatory elements directing tuber-specific and sucrose-inducible expression of a chimeric classⅠ patatin promoter/GUS-gene fusion[J].Mol Gen Genet,1990,223(3):401-406.

[13]Iglesias A A,Barry G F,Meyer C,et al.Expression of the potato tuber ADP-glucose pyrophosphorylase in Escherichia coli[J].The Journal of Biological Chemistry,1993,268(2): 1 081-1 086.

Cloning and Sequencing the GBSS of Potato Tuber Tissue-specific Promoter Region

CHEN Guoliang,CHEN Zongli,QI Xiangying,HE Xiaolong
(College of Life Science,Yan'an University/Shanxi Engineering&Technological Research Center for Conversation& Utilization of Regional Biological Resources,Yan'an,Shanxi 716000)

The GBSS gene promoter region was amplified from solanum tuberosumn genomic DNA by polymerase chain reaction(PCR)and cloned into the T-vector.The sequence analysis showed that the sequence size was 599 bp,its homology was 99.67%with published sequence of the GBSS promoter in Genebank.Using PLACE and PlantCare sequence database analysis showed that the fragment containing the conserved promoter sequence,such as TATA-box,CAAT-box.In addition,the fragment containing TAACAAA,CTAACAC,CTCTT and CACT specific gene sequences may be necessary for specific expression.

Potato;Tissue-specific;Promoter;PCR

10.3865/j.issn.1001-3547.2011.08.008

陜西省教育廳省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室重點(diǎn)科研計(jì)劃項(xiàng)目（2010JS065），延安市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2010kn-03），延安大學(xué)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目、延安大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（YD2008-106）

陳國梁（1974-），男，碩士,講師，研究方向?yàn)橹参锷锛夹g(shù)

陳宗禮，通信作者，E-mail：zongli_chen@yahoo.com.cn

2011-03-15