李念祖，湯青林，王志敏，宋明

（西南大學(xué)園藝園林學(xué)院；南方山地園藝學(xué)教育部重點實驗室；重慶市蔬菜學(xué)重點實驗室，重慶，400715）

花椰菜游離小孢子培養(yǎng)研究進展

李念祖，湯青林，王志敏，宋明

（西南大學(xué)園藝園林學(xué)院；南方山地園藝學(xué)教育部重點實驗室；重慶市蔬菜學(xué)重點實驗室，重慶，400715）

分析了影響花椰菜游離小孢子培養(yǎng)的主要因素（材料基因型、小孢子發(fā)育時期、預(yù)處理和預(yù)培養(yǎng)、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)技術(shù)），并對胚狀體發(fā)生與植株再生、DH純系獲得等的研究情況進行了闡述，展望了游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展前景。

花椰菜；游離小孢子；培養(yǎng)條件

花椰菜 （Brassica oleraceaL.var.botrytis）又稱花菜、菜花、椰菜花，是十字花科蕓薹屬甘藍種以花球為主要產(chǎn)品的一個變種。它富含多種維生素和微量元素，具有較高的食用價值，在我國蔬菜生產(chǎn)中占有重要地位。常規(guī)育種技術(shù)純化種質(zhì)資源效率低、周期長，而游離小孢子培養(yǎng)（isolated microspore culture，IMC）技術(shù)又叫花粉培養(yǎng)（pollen culture），是指直接從花蕾或花藥中游離出合適的小孢子群體，在液體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)形成小孢子胚和再生植株的過程。該技術(shù)是在單細胞水平上獲得雙單倍體（doubled haploid，DH）純系的方法，主要包括小孢子胚的誘導(dǎo)、再生植株和DH系形成3個過程。游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)是一種有效的生物技術(shù)育種方法，可在1～2 a內(nèi)獲得優(yōu)良自交系和自交不親和系，用于育種可縮短育種年限，從而提高育種效率，與常規(guī)多代自交獲得純系相比，具有周期短、效率高、純系穩(wěn)定等特點。

1 小孢子胚的誘導(dǎo)

1.1 基因型的選擇

基因型是影響小孢子胚胎發(fā)生率的關(guān)鍵因素。不同基因型材料在相同試驗條件下培養(yǎng)，胚狀體產(chǎn)量不同。方淑桂等[1]以80份早中熟花椰菜栽培種為材料進行小孢子培養(yǎng)時，有20份材料誘導(dǎo)出胚狀體，誘導(dǎo)率為25%；基因型不同，產(chǎn)胚量差異也較大，在能出胚的基因型中，產(chǎn)胚量最高每蕾平均36.0個，最低的每蕾只有0.2個，相差182.5倍。趙前程等[2]的186個試材中，有55個材料得到了小孢子胚，培養(yǎng)反應(yīng)率為29.6%。由此可見，小孢子胚胎發(fā)生能力同其他遺傳性狀一樣，是受基因調(diào)控的遺傳特性，對較難誘導(dǎo)的基因型，可通過與易誘導(dǎo)材料雜交后再培養(yǎng)，提高胚誘導(dǎo)率。

1.2 小孢子的發(fā)育時期

花蕾大小，即小孢子所處的發(fā)育時期，是影響培養(yǎng)效果的關(guān)鍵因素之一。植株發(fā)育狀態(tài)直接影響小孢子的生理生化特性和小孢子的發(fā)育方向，通常認(rèn)為小孢子培養(yǎng)的最佳時期是單核晚期至雙核早期。趙前程等[2]在試驗中以單核早期、單核靠邊期、雙核期和三核期的小孢子進行培養(yǎng)，研究不同發(fā)育階段對小孢子胚狀體發(fā)生的影響，結(jié)果表明，單核靠邊期到雙核期的小孢子培養(yǎng)出胚率高，而在三核期和單核早期進行花椰菜小孢子培養(yǎng)不能獲得胚狀體。這與方淑桂等[1]的研究結(jié)果一致，盛花前期培養(yǎng)的小孢子產(chǎn)胚量最高，比其他時期培養(yǎng)的高20%以上，差異達極顯著水平。

1.3 預(yù)處理和預(yù)培養(yǎng)

為了提高花粉培養(yǎng)的效率，通常對試驗材料進行預(yù)處理。預(yù)處理包括高溫、離心、低溫、射線、甘露醇或預(yù)培養(yǎng)等方式，其目的就是從生理生化上改變細胞生理狀態(tài)、分裂方式和發(fā)育途徑，有效地抑制小孢子的配子體發(fā)育途徑，提高單核小孢子核對稱分裂的頻率。顧宏輝等[3]的研究結(jié)果表明，不同的熱激溫度與熱激時間組合對花椰菜小孢子培養(yǎng)胚產(chǎn)量有顯著的影響，32℃熱激處理24 h，小孢子胚產(chǎn)量顯著高于其他組合，這與Dias[4]發(fā)表的結(jié)論相一致，而Duijs等[5]研究卻發(fā)現(xiàn)30℃處理48 h最合適，方淑桂等[1]研究認(rèn)為33℃處理48 h最適宜。

1.4 培養(yǎng)基成分

①蔗糖的濃度 蔗糖不僅作為碳源為游離小孢子提供能量并且還是小孢子的滲透調(diào)節(jié)劑，其濃度大小對小孢子存活及是否發(fā)育成胚具有很大的影響。張曉芬等[6]在研究花椰菜游離小孢子培養(yǎng)時，比較了含10%，13%和16%蔗糖的培養(yǎng)基的出胚率，結(jié)果顯示含13%蔗糖的NLN培養(yǎng)基胚胎發(fā)生率最高。

②激素的影響 在培養(yǎng)基中添加6-BA，NAA對游離小孢子培養(yǎng)的影響已經(jīng)有很多研究。在趙前程等[7]的研究中，當(dāng)1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA組合使用時，愈傷組織發(fā)育速度較快，愈傷組織質(zhì)量最好，能夠進一步誘導(dǎo)獲得胚芽。而6-BA 1.0 mg/L+ NAA 0.1 mg/L的激素組合最適宜花椰菜胚胎愈傷組織分化形成再生植株，愈傷組織分化率達到100%，平均每塊愈傷組織的胚芽分化數(shù)量達到6.52個。

③活性炭的影響 孫丹等[8]研究表明，在培養(yǎng)基中添加0.10 mg/L活性炭能增加大多數(shù)品種的胚產(chǎn)量。原因可能是適量的活性炭可以吸附一些由于胚胎滋生產(chǎn)生的代謝物質(zhì)，從而促進胚胎發(fā)育。趙前程等[7]對花椰菜小孢子的研究表明，在胚胎轉(zhuǎn)移到脫分化培養(yǎng)基的初期，添加100 mg/L的活性炭可以減少胚胎褐化、死亡，這個結(jié)果與姜鳳英等[9]的研究結(jié)果相一致。試驗中還發(fā)現(xiàn)，活性炭添加在固體培養(yǎng)基表面比混合在培養(yǎng)基中效果更好。韓陽等[10]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的活性炭對小孢子胚的發(fā)生表現(xiàn)出抑制作用。原因可能在于活動炭的吸附作用無選擇性，當(dāng)其濃度超過適宜濃度后，在吸附培養(yǎng)基中有害物質(zhì)的同時，也吸附了生長調(diào)節(jié)劑、鐵鹽、維生素等與胚生長和分化密切相關(guān)的有益物質(zhì)。

1.5 接種密度的影響

接種密度是影響小孢子培養(yǎng)能否成功的一個至關(guān)重要的因素，也是在試驗操作中常常被忽略的問題。每1 mL培養(yǎng)基接種1.5～2個花蕾的小孢子較適宜，多數(shù)研究者采用每1 mL培養(yǎng)基接種2個花蕾的小孢子，若每1 mL培養(yǎng)基接種2個以上花蕾，其產(chǎn)胚率下降，甚至不能形成胚狀體[11]。因為小孢子濃度過高時，會消耗大量的營養(yǎng)物質(zhì)，并且釋放許多有害物質(zhì)，影響胚的發(fā)育。但小孢子發(fā)育需要群體效應(yīng)，濃度過低同樣不利于小孢子胚胎的生長發(fā)育。趙前程等[7]對花椰菜小孢子培養(yǎng)時，小孢子培養(yǎng)密度為1×105～2×105個/mL時，出胚率較高。因為適宜培養(yǎng)的花蕾數(shù)目，可能與操作方法有關(guān)，所以應(yīng)該利用血球計數(shù)板觀測并計算出較為準(zhǔn)確的小孢子密度。

1.6 更換培養(yǎng)液

在小孢子培養(yǎng)初期更新培養(yǎng)液能夠提高胚狀體產(chǎn)量，從而減少愈傷狀胚的形成，但更換培養(yǎng)液需要重新離心，對正在膨大和分裂的小孢子有一定的損害。此外培養(yǎng)初期將高糖濃度換成低糖濃度能夠顯著提高小孢子培養(yǎng)的產(chǎn)胚率。另外，加液培養(yǎng)也能提高胚狀體誘導(dǎo)頻率，因為加液培養(yǎng)能夠稀釋細胞毒素，同時還能補充營養(yǎng)物質(zhì)。顧宏輝等[3]對冬性花椰菜進行小孢子培養(yǎng)，結(jié)果表明，更換培養(yǎng)液，即在NLN-13起始培養(yǎng)液下培養(yǎng)24 h后，換成新鮮的NLN-13培養(yǎng)液，或?qū)LN-17換成NLN-10，均能明顯改善胚體形狀，減少愈傷狀胚的數(shù)量，從而提高正常胚體率。方淑佳等[1]對花椰菜進行小孢子培養(yǎng)時，為了維持小孢子的活力，起始培養(yǎng)用含16%蔗糖的培養(yǎng)液，3 d后加入等量的含10%蔗糖的培養(yǎng)液，使蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)稀釋到13%，出胚率與13%蔗糖的培養(yǎng)液對照相比增長205.08%。

1.7 振蕩培養(yǎng)

一般液體培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)容易被小孢子吸收，但由于透氣不良，會有褐色胚產(chǎn)生。小孢子在培養(yǎng)14 d后，由靜置培養(yǎng)改為60 r/min振蕩培養(yǎng)，可以改善液體培養(yǎng)基的通氣性，使子葉胚率大大提高，胚也更健壯，提高了胚發(fā)育的同步性和胚質(zhì)量，促使了胚在成苗培養(yǎng)基上直接成苗[9]。

2 胚狀體的發(fā)生及植株再生

小孢子分離后，經(jīng)過高溫?zé)釗艉统嘏囵B(yǎng)，約30 d可得到子葉期胚狀體；胚狀體經(jīng)過誘導(dǎo)、萌發(fā)和繼代培養(yǎng)，5～6周可獲得再生植株；然后進入繼代（增殖）階段，待室外條件適宜再生植株移栽時，室外煉苗約1周后，將再生植株移入穴盤中。顧宏輝等[12]試驗結(jié)果表明，不同花椰菜品種對小孢子培養(yǎng)的反應(yīng)不同。胚狀體產(chǎn)量最高的品種平均每花蕾胚產(chǎn)量達45.6個，最高每花蕾胚產(chǎn)量達到112個，而早花45 d小孢子未能誘導(dǎo)出胚。胚狀體對萌發(fā)培養(yǎng)基的反應(yīng)也不盡相同。胚狀體生育期、數(shù)量、大小均對萌發(fā)率有影響。再生植株的生成還受到培養(yǎng)基水分、通氣、光照、溫度的影響。劉凡等[13]研究發(fā)現(xiàn)，成熟的小孢子胚在NLN（13%）液體培養(yǎng)基中停留時間的長短對以后的胚培養(yǎng)影響甚大，在液體培養(yǎng)基中停留14 d和21d的小孢子胚轉(zhuǎn)移至MS0培養(yǎng)基培養(yǎng)56 d時成苗率分別為85%和81.6%，停留28 d和35 d的小孢子胚最終成苗率只有63.3%和42.7%。周偉軍等[14]發(fā)現(xiàn)，胚狀體轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基后立即進行低溫誘導(dǎo)（2℃）處理10 d，其萌發(fā)率和成苗率均顯著高于無低溫處理。

3 DH純系獲得

DH純系獲得包括小孢子植株的加倍和DH后代的性狀鑒定等。研究發(fā)現(xiàn)，同一小孢子來源的個體，其性狀、花期等高度一致，在遺傳上是純合的；不同小孢子來源的植株后代，其性狀、花期、株高、分枝數(shù)等均有差異，出現(xiàn)親和、不親和等不同變異類型，可進行選擇利用。小孢子再生株后代自交結(jié)實正常，單株種子量在2 g以上，倍性穩(wěn)定，可直接用于品種選育。小孢子植株有單倍體、二倍體及多倍體等類型，植株自然加倍率為60%～70%，有利于形成DH株系，在育種中具有重要意義。如需人工加倍，主要用0.2～4.0 mg/L秋水仙堿處理單倍體植株[15]。

4 展望

經(jīng)過國內(nèi)外學(xué)者數(shù)10 a的研究探索，游離小孢子培養(yǎng)的技術(shù)已越來越完善，胚狀體的誘導(dǎo)頻率也有了顯著提高，這為游離小孢子的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)可大大縮短育種年限，提高育種效率，具有單細胞單倍性、群體數(shù)量多、自然分散性好、不受體細胞干擾、便于遺傳操作等優(yōu)點，因此游離小孢子培養(yǎng)方法還可以應(yīng)用于誘變和突變體篩選、基因轉(zhuǎn)化等研究，通過花粉培養(yǎng)建立的雙單倍體群體更是分子標(biāo)記和基因圖譜的理想材料。但是還應(yīng)看到，目前花椰菜游離小孢子培養(yǎng)在啟動機理、微觀發(fā)育機制、發(fā)育途徑等理論研究，以及與之相關(guān)的外界環(huán)境對游離小孢子生長的生理生化方面研究還十分欠缺，還沒有建立起完善高效的再生體系。所以今后應(yīng)在花椰菜游離小孢子研究中，加強基因型、微觀發(fā)育調(diào)控和外界條件對花椰菜游離小孢子生長發(fā)育的研究。

[1]方淑桂，朱朝輝，曾小玲，等.花椰菜游離小孢子培養(yǎng)及影響因子[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2006，21（2）：138-142.

[2]趙前程，吉立柱，蔡榮旗，等.花椰菜游離小孢子培養(yǎng)及植株再生研究[J].華北農(nóng)學(xué)報，2007，22（6）：65-68.

[3]顧宏輝，唐桂香，張國慶，等.冬性花椰菜的小孢子胚誘導(dǎo)和植株再生研究[J].浙江大學(xué)學(xué)報：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2004，30（1）：34-38.

[4]Dias J S.Effect of incubation temperature regimes and culture medium on broccoli microspore culture embryogenesis [J].Euphtica,2001,119:389-394.

[5]Duijs J G R,Voorrips E,Visser D L,et al.Microspore culture is successful in most types ofBrassica oleraceaL.[J]. Euphytica,1992,60:45-55.

[6]張曉芬，王曉武，張延國，等.花椰菜游離小孢子培養(yǎng)再生植株研究[J].中國蔬菜，2005（1）：16-17.

[7]趙前程，佟志強，蔡榮旗，等.提高花椰菜游離小孢子胚胎植株再生率研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（7）：77-79.

[8]孫丹，王濤濤，葉志彪，等.基因型和活性炭對大白菜小孢子胚胎發(fā)生的影響[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005（6）：73-75.

[9]姜鳳英，馮輝，李娜，等.甘藍類植物游離小孢子培養(yǎng)研究進展[J].遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006（5）：28-30.

[10]韓陽，葉雪凌，馮輝.大白菜小孢子培養(yǎng)影響因素研究[J].中國蔬菜，2006（7）：16-18.

[11]李維薇，藺忠龍，白現(xiàn)廣，等.大白菜游離小孢子培養(yǎng)最新研究進展[J].北方園藝，2009（2）：133-135.

[12]顧宏輝，朱丹華，楊加付，等.小孢子培養(yǎng)獲得松花型花椰菜DH再生植株[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2007，15（2）：301-305.

[13]劉凡，李巖，姚磊，等.培養(yǎng)基水分狀況對大白菜小孢子胚成苗的影響[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，1997，5（2）：131-136.

[14]周偉軍，毛碧增，顧宏輝，等.秋水仙堿及熱擊與低溫誘導(dǎo)對油菜小孢子胚狀體成苗率的影響[J].作物學(xué)報，2002，28（3）：369-373.

[15]蔣武生，張曉偉，原玉香，等.大白菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)研究進展及應(yīng)用[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（9）：151-154.

Research on Dissociated Microspore's Culture ofBrassica oleraceavar.botrytis

LI Nianzu,TANG Qinglin,WANG Zhimin,SONG Ming
(College of Horticulture and Landscape Architecture,Southwest University/Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions,Ministry of Education/Key Laboratory of Olericulture,Chongqing 400715)

This article summarized the main factors which affect the dissociated microspore's culture ofBrassica oleracea var.botrytis(the genotype of the material,the growth period of the dissociated microspores,pretreatment and pre-cultivation,the consisting of the culture,the technology),the embryoid's occurrence,the regeneration of the plant,and also the acquirement of DH lines are related.The foreground of the dissociated microspore's culture was also prospected.

Brassica oleraceavar.botrytis;Dissociated microspore;Culture condition

10.3865/j.issn.1001-3547.2011.08.002

國家自然科學(xué)基金（31000908），中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金（XDJK2009C124），重慶市自然科學(xué)基金（2009BB1307），西南大學(xué)博士基金（SWU110009）

李念祖（1987-），男，碩士，從事蔬菜遺傳育種與生物技術(shù)研究，E-mail：linianzu@sina.cn

宋明，通信作者，E-mail：swausongm@yahoo.com.cn

2011-03-30