張潔 蔣海越 何樂仁 趙延勇 楊慶華 韓娟 宋宇鵬

殘耳軟骨細(xì)胞與脂肪干細(xì)胞共培養(yǎng)體內(nèi)構(gòu)建軟骨的實(shí)驗(yàn)研究

張潔 蔣海越 何樂仁 趙延勇 楊慶華 韓娟 宋宇鵬

目的驗(yàn)證殘耳軟骨細(xì)胞與脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（Adipose derived stem cells，ADSCs）共培養(yǎng)，體內(nèi)構(gòu)建軟骨的可行性。方法分離培養(yǎng)同一先天性小耳畸形患者來源的殘耳細(xì)胞及脂肪干細(xì)胞。24只裸鼠隨機(jī)分為4組：①實(shí)驗(yàn)組，接種殘耳細(xì)胞及脂肪干細(xì)胞，兩種細(xì)胞以1∶1比例混合，細(xì)胞濃度為5.0×107cells/mL；②對(duì)照組1，接種單純殘耳軟骨細(xì)胞，細(xì)胞濃度為5.0×107cells/mL；③對(duì)照組2，接種單純ADSCs，細(xì)胞濃度為5.0×107cells/mL；④對(duì)照組3，接種單純殘耳軟骨細(xì)胞，細(xì)胞濃度為2.5×107cells/mL。每組接種6只裸鼠，每只接種0.2 mL。體內(nèi)培養(yǎng)10周后取材。通過對(duì)新生組織的大體觀察、測(cè)量濕重、糖胺多糖含量測(cè)定、組織學(xué)及免疫組化染色等方法對(duì)各組新生軟骨進(jìn)行比較。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組1與對(duì)照組3新生為不同組織量的軟骨樣組織，對(duì)照組2形成纖維樣組織；實(shí)驗(yàn)組平均濕重及糖胺多糖含量達(dá)到對(duì)照組1的88%以上，對(duì)照組3平均濕重低于對(duì)照組1的40%；HE染色示實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組1與對(duì)照組3的標(biāo)本均有軟骨陷窩形成，對(duì)照組2未見軟骨陷窩形成；Ⅱ型膠原免疫組化染色示實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組1與對(duì)照組3均可見Ⅱ型膠原表達(dá)；對(duì)照組2未見Ⅱ型膠原表達(dá)。結(jié)論體內(nèi)共培養(yǎng)條件下，殘耳軟骨微環(huán)境可有效促進(jìn)脂肪干細(xì)胞向軟骨方向分化，殘耳軟骨細(xì)胞與脂肪干細(xì)胞共培養(yǎng)體內(nèi)構(gòu)建軟骨具備可行性。

共培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞殘耳軟骨細(xì)胞體內(nèi)

小耳畸形是整形外科常見的先天體表畸形，嚴(yán)重影響患者的容貌和身心健康，耳廓再造術(shù)是目前最有效的治療手段，而耳廓再造術(shù)的關(guān)鍵之一是耳廓軟骨支架的制備。目前常用的耳廓支架制備材料為自體軟骨組織制備的軟骨耳廓支架，與人工高分子成品耳廓支架相比，具有組織相容性好，無排異反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，臨床效果良好。組織工程的發(fā)展為耳廓再造提供了新的途徑。BMSCs已被證實(shí)具有向軟骨方向分化的能力[1-2]，隨后也發(fā)現(xiàn)ADSCs也具有向軟骨分化并形成軟骨樣組織的能力[3]。ADSCs是一類增殖能力強(qiáng)、具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，研究證實(shí)該細(xì)胞體外大規(guī)模擴(kuò)增后仍保留向軟骨方向分化的能力[4-5]。ADSCs與BMSCs相比，具有來源廣，易獲得，創(chuàng)傷小，純化率高，體外增殖速度快等優(yōu)點(diǎn)，是構(gòu)建軟骨組織理想的種子細(xì)胞。相關(guān)研究表明，BMSCs在軟骨細(xì)胞提供的軟骨微環(huán)境中能有效地被誘導(dǎo)向軟骨方向分化并形成軟骨[6-7]。本研究試圖探索殘耳軟骨細(xì)胞微環(huán)境能否誘導(dǎo)ADSCs向軟骨細(xì)胞分化，以及殘耳軟骨細(xì)胞與脂肪干細(xì)胞共培養(yǎng)體內(nèi)構(gòu)建軟骨的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)標(biāo)本為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院外耳整形再造中心外耳再造術(shù)中廢棄的殘耳軟骨組織及脂肪組織，與患者家屬簽訂知情同意書，患者年齡為5～20歲。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脂肪干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

取術(shù)中廢棄的皮下脂肪組織，剝除肉眼可見的筋膜，小血管等脂肪周圍組織后，剪成1mm3大小組織塊，加入終濃度為0.075%的Ⅰ型膠原酶（Invitrogen公司，美國），37℃搖床內(nèi)消化40 min，120 r/min；10%FBS（Gibco公司，美國）的低糖DMEM培養(yǎng)基終止消化，200目濾網(wǎng)過濾，1 500 r/min離心5 min，去上清后加入完全培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)后以細(xì)胞濃度為5×104cell/cm2接種培養(yǎng)皿內(nèi)，37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱（Thermo公司，美國）內(nèi)培養(yǎng)，每2～3天更換一次培養(yǎng)液。待細(xì)胞融合達(dá)85%后傳代。收集第3代細(xì)胞備用。

1.2.2 殘耳軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

取術(shù)中廢棄的殘耳軟骨組織，去除軟骨組織膜及周圍組織后剪成2 mm×2 mm×2 mm的組織塊，加入4倍體積量的2%膠原酶（Invitrogen公司，美國），37℃搖床內(nèi)消化10～12 h，200目濾網(wǎng)過濾，2 000 r/min離心8 min，去上清后加入完全培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)后以細(xì)胞濃度為1×104cells/cm2接種培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2～3天更換一次培養(yǎng)液。待細(xì)胞融合達(dá)85%后傳代。收集第2代細(xì)胞備用。

1.2.3 可降解支架材料準(zhǔn)備

電子天平稱取3 g固體粉末Pluronic F-127（Sigma公司，美國），加入10 mL無血清高糖DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國），充分?jǐn)嚢?、溶解?26℃高溫高壓下消毒處理，4℃存放備用。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為4組，每組接種6只裸鼠（6周，雌性）（北京維通利華公司），每只接種0.2 mL，共接種24只。實(shí)驗(yàn)組：殘耳軟骨細(xì)胞與ADSCs以1∶1的比例混合，細(xì)胞接種終濃度為5.0×107cells/mL；對(duì)照組1：?jiǎn)渭冘浌羌?xì)胞，細(xì)胞接種終濃度5.0×107cells/mL；對(duì)照組2：?jiǎn)渭傾DSCs，細(xì)胞接種終濃度5.0×107cells/mL；對(duì)照組3：?jiǎn)渭冘浌羌?xì)胞，細(xì)胞接種終濃度2.5×107cells/mL。

1.2.5 細(xì)胞接種

按以上實(shí)驗(yàn)分組中的細(xì)胞種類、細(xì)胞比例以及終濃度將細(xì)胞與0.2 mL 30%的Pluronic F-127冰上混勻，用20 mL注射器注射到裸鼠皮下。10周后取材。

1.2.6 新生組織相關(guān)評(píng)價(jià)指標(biāo)的檢測(cè)

形態(tài)學(xué)觀察新生組織的形態(tài)、大小和色澤，用鑷子鉗夾判斷新生組織的彈性；稱重，比較各組濕重平均值的差異；阿利辛藍(lán)比色法檢測(cè)各組糖胺多糖（GAG）含量平均值（組織糖胺多糖總含量阿爾新藍(lán)比色法定量檢測(cè)試劑盒，上海杰美公司）；將組織塊以4%中性福爾馬林固定、石蠟包埋、切片，HE染色，觀察細(xì)胞基本形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)；甲苯胺藍(lán)染色及Safranin O染色觀察軟骨組織的異染程度及基質(zhì)中GAG的分泌情況；Ⅱ型膠原免疫組化染色觀察各組標(biāo)本Ⅱ型膠原表達(dá)情況。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)均用x±s表示，應(yīng)用SPASS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組1、對(duì)照組3注射部位均有乳白色軟骨樣組織形成；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組1新生組織的大小相仿，外觀和彈性類似于正常軟骨；對(duì)照組3新生組織量明顯低于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組1，組織彈性也較差。對(duì)照組2未生成軟骨樣組織，而是形成淡黃色，質(zhì)軟的纖維樣組織（圖1）。

2.2 新生組織平均濕重比較

實(shí)驗(yàn)組：177±14.4 mg；對(duì)照組1：200.67±13.42 mg；對(duì)照組2：73.3±8.6 mg；對(duì)照組3：78±8 mg。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組3具有相同的初始?xì)埗浌羌?xì)胞接種量，實(shí)驗(yàn)組平均濕重達(dá)到對(duì)照組1的88.5%，而對(duì)照組3平均濕重僅為對(duì)照組1的38.87%（P＜0.05）。證明相同的初始?xì)埗浌羌?xì)胞量，在共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組生成的軟骨組織量要比單獨(dú)培養(yǎng)組高（圖2）。

2.3 新生組織平均GAG含量比較

實(shí)驗(yàn)組中單位重量新生組織中糖胺多糖含量的平均值達(dá)到對(duì)照組1的91.2%，對(duì)照組3僅達(dá)到對(duì)照組1的66.4%（圖3）。

2.4 組織學(xué)染色

HE染色示除對(duì)照組2形成纖維樣組織，未發(fā)現(xiàn)軟骨陷窩外，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組1與對(duì)照組3的標(biāo)本均有軟骨陷窩形成，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組1形成的軟骨陷窩形狀大小與正常軟骨組織相類似，分布較均勻。對(duì)照組3軟骨陷窩明顯變大，且形狀、大小差異較大，陷窩間距增寬，且分布不均（圖4）；Safranin O、甲苯胺藍(lán)染色顯示，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組1與對(duì)照組3均為陽性，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組1著色深度較一致，對(duì)照組3著色較淺（圖5）。Ⅱ型膠原免疫組化染色證實(shí)3組樣本均有Ⅱ型膠原表達(dá)，對(duì)照組3著色較淺（圖6）。

圖1 各組標(biāo)本大體觀察Fig.1Gross view of the specimens in all groups

圖2 各組標(biāo)本濕重Fig.2Wet weight in all groups

圖3 各組標(biāo)本GAG含量Fig.3GAG content in all groups

圖4 各組HE染色（400×）Fig.4 HE staining for of the specimens in all groups(400×)

圖5 各組Safranin O染色及甲苯胺藍(lán)染色（200×）Fig.5Safranin O and Toluidine Blue staining for the specimens in all groups(200×)

圖6 各組Ⅱ型膠原免疫組化染色（200×）Fig.6Collagen typeⅡimmunohistochemistry staining for the specimens in all groups(200×)

3 討論

構(gòu)建組織工程軟骨耳廓最主要的問題是種子細(xì)胞的來源問題，小耳畸形患者的殘耳軟骨組織往往較小，不足以提供足量的殘耳軟骨細(xì)胞，而過度體外擴(kuò)增，軟骨細(xì)胞將逐漸失去表型及分泌軟骨基質(zhì)的能力，轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，失去成軟骨的能力[7-8]。因此，具有強(qiáng)大增殖和多向分化能力的干細(xì)胞，尤其是來源廣，易獲得，純化率高，體外增殖速度快的脂肪干細(xì)胞有望成為構(gòu)建軟骨組織的理想種子細(xì)胞。脂肪干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)研究較多，但傳統(tǒng)的誘導(dǎo)方法需要大量的生長(zhǎng)因子，誘導(dǎo)方案較昂貴，從實(shí)驗(yàn)研究到臨床運(yùn)用的轉(zhuǎn)化較難。

研究發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞微環(huán)境能有效促進(jìn)多分化潛能的干細(xì)胞向軟骨方向分化，形成軟骨樣組織并修復(fù)缺損[9-10]。微環(huán)境作用的機(jī)制可能為：軟骨細(xì)胞分泌TGF-β、IGF等生長(zhǎng)因子，誘導(dǎo)干細(xì)胞向軟骨方向分化[7]；相鄰細(xì)胞間的相互作用[8]；分泌軟骨微環(huán)境特異性細(xì)胞外基質(zhì)，作用于細(xì)胞的增殖、分化、黏附及細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)等。另有文獻(xiàn)報(bào)道，與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)的BMSCs能向軟骨方向分化，在體外形成軟骨樣組織[9]。因此，我們將殘耳軟骨細(xì)胞與ADSCs體內(nèi)共培養(yǎng)，探索殘耳軟骨細(xì)胞微環(huán)境能否誘導(dǎo)ADSCs向軟骨細(xì)胞分化，以及殘耳軟骨細(xì)胞與ADSCs共培養(yǎng)體內(nèi)構(gòu)建軟骨的可行性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，除對(duì)照組2外，其余各組均能形成軟骨組織。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組1所形成組織的組織量相近，組織學(xué)染色結(jié)果類似，色澤彈性與正常耳廓軟骨無明顯區(qū)別。而對(duì)照組3形成的軟骨樣組織量明顯少于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組1，且彈性較差。對(duì)照組2未形成軟骨樣組織。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組3含有相同的起始?xì)埗浌羌?xì)胞數(shù)，然而前者形成組織的平均濕重及GAG含量分別達(dá)到對(duì)照組1的88.5%與91.2%；后者平均值明顯小于對(duì)照組1平均值。由此可推斷，殘耳軟骨細(xì)胞微環(huán)境對(duì)脂肪干細(xì)胞的軟骨方向分化具有確切的促進(jìn)作用，共培養(yǎng)組中的脂肪干細(xì)胞能替代一定量的殘耳軟骨細(xì)胞形成軟骨樣組織，殘耳軟骨細(xì)胞與脂肪干細(xì)胞共培養(yǎng)體內(nèi)構(gòu)建軟骨是可行的。

[1]Johnstone B,Hering TM,Caplan AI,et al.In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells[J].Exp Cell Res,1998,238(1):265-272.

[2]Mackay AM,Beck SC,Murphy JM,ea al.Chondrogenic differentiation of cultured human mesenchymal stem cells from marrow[J].Tissue Eng,1998,4(4):415-428.

[3]Zuk PA,Zhu M,Mizuno H,et al.Multilineage cells from human adipose tissue:Implications for cell-based therapies[J].Tissue Eng,2001,7(2):211-216.

[4]Estes BT,Wu AW,Storms RW,et al.Extended passing,but not aldehyde dehydrogenase activity,increases the chondrogenic potential of human adipose-derive adult stem cells[J].J Cell Physiol,2006,209(3):987-995.

[5]Huang JI,Beanes SR,Zhu M,et al.Rat extramedullary adipose tissue as a source of osteochondrogenic progenitor cells[J].Plast Reconstr Surg,2002,109(3):1033－1041.

[6]Im Gl,Kim DY,Shin JH,et al.Repair of cartilage defect in the rabbit with culture mesenchymal cell transplantation to cartilage defect[J].J Bone Joint Surg Br,2001,83(2):289-294.

[7]Langer R,Vacanti JP.Tissue engineering[J].Science,1993,260 (5110):920-926.

[8]Dinser R,Kreppel F,Zaucke F,et al.Comparison of long-term transgene expressiong after non-viral and adenoviral gene transfer into primary articular chondrocytes[J].Histochem Cell Biol,2001, 116(1):69-77.

[9]Xia Liu,Hengyun Sun,Dan yan,et al.In vivo ectopic chondrogenesis of BMSCs directed by mature chondrocyetes[J].Biomaterials,2010, 31(36):9406-9414.

[10]周廣東,王曉云,苗春雷,等.骨髓基質(zhì)細(xì)胞修復(fù)豬膝關(guān)節(jié)非負(fù)重區(qū)軟骨與骨復(fù)合缺損的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國醫(yī)學(xué)雜志,2004,84(11): 925-931.

[11]Hwang NS,Varghese S,Puleo C,et al.Morphogenetic signals from chondrocytes promotes chondrogenic and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells[J].J Cell Physiol,2007,212(2):281-284.

[12]Grassel S,Ahmed N.Influence of cellular microenvironment and paracrine signals on chondrogenic differentiation[J].Front Biosci, 2007,12:4946-4956.

[13]周廣東,苗春雷,王曉云,等.軟骨細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體外軟骨形成的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國醫(yī)學(xué)雜志，2004,84(20):1716-1719.

本刊對(duì)來稿中圖、表的要求

圖和表的共同要求：每幅圖或表均應(yīng)冠有中文和英文圖題或表題，圖和表以及圖注中的文字用中英文敘述；圖或表的數(shù)量要精選；每幅圖或表要單占1頁，分別按其在正文中出現(xiàn)的先后次序連續(xù)編碼，全文只有1幅圖時(shí)圖序?yàn)閳D1，只有1個(gè)表時(shí)表序?yàn)楸?，不可寫附圖或附表；每幅圖或表在正文中均應(yīng)有標(biāo)示；圖或表注應(yīng)置于圖或表下方，圖注和表注的次序編號(hào)采用阿拉伯?dāng)?shù)字；圖或表注中表明使用的全部非共知公認(rèn)的縮寫；圖和表中如有引自他刊者，應(yīng)注明出處。

表的具體要求：一律采用三橫線表，表內(nèi)不能出現(xiàn)豎線或斜線；表內(nèi)每一欄均應(yīng)有表頭；如遇有合計(jì)或統(tǒng)計(jì)學(xué)處理內(nèi)容（如t值、P值等），則在此行上面加一條分界橫線；表內(nèi)共同的計(jì)量單位符號(hào)和數(shù)值表述方式應(yīng)加括號(hào)置于表題后，并以逗號(hào)隔開，如：（mol·L-1，x±s）；表內(nèi)數(shù)字以個(gè)位數(shù)、小數(shù)點(diǎn)或±為中心上下對(duì)齊；表內(nèi)同一指標(biāo)數(shù)據(jù)有效位數(shù)應(yīng)一致，一般按標(biāo)準(zhǔn)差（s）的1/3確定有效位數(shù)。

圖的具體要求：線條圖應(yīng)盡可能在計(jì)算機(jī)上繪制；照片宜用數(shù)碼相機(jī)拍攝（分辨率不低于300 dpi）并有良好的清晰度和對(duì)比度；膠片沖洗的黑白圖和彩色圖最好掃描（分辨率不低于300 dpi），以計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)方式傳送，請(qǐng)不要提供計(jì)算機(jī)打印的圖片，圖片大小為7.5 cm×4.5 cm，圖中需標(biāo)注的符號(hào)、圖號(hào)、上下方向應(yīng)以不妨礙閱圖，同時(shí)兼顧美感為準(zhǔn)；圖片若刊用人像，應(yīng)提供征得本人同意的書面材料，或遮蓋其能被辨認(rèn)出系何人的部分；大體標(biāo)本照片在圖內(nèi)應(yīng)有刻度尺標(biāo)記；病理照片要求注明染色方法和放大倍數(shù)。

The Experimental Studies of the Tissue Engineering Cartilage by Co-Culturing Microtia Chondrocytes and Adipose Tissue-Derived Stem Cells in Vivo

ZANG Jie,JIANG Haiyue,HE Leren,ZHAO Yanyong,YANG Qinhua,HAN Juan，SONG Yupeng.Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Science,Beijing 100144,China.Corresponding author:JIANG Haiyue(E-mail:jianghaiyue@sohu.com).

ObjectiveTo explore the feasibility of the chondrogenesis by co-culturing microtia chondrocytes and human adipose tissue-derived stem cells in vivo.MethodshADSCs and microtia chondrocytes were isolated in vitro.24 nude mice were randomly divided into 4 groups:①Exp group,injected with microtia chondrocytes and hADSCs by a mixing ratio of 1∶1 and the cell concentration was 5.0×107cells/mL;②Ctrl 1 group,injected with only microtia chondrocytes and the cell concentration was 5.0×107cells/mL;③Ctrl 2 group,injected with only hADSCs and the cell concentration was 5.0×107cells/ mL;④Ctrl 3 group,injected with only microtia chondrocytes and the cell concentration was 2.5×107cells/ml.6 nude mice were injected each group at a dose of 0.2 mL.All samples were harvested 10 weeks after culturing in vivo.Gross observation, average wet weights,glycosaminoglycan(GAG)quantification,histology and immunohistochemisty were used to evaluate the chondrogenesis of all groups.ResultsIn Exp,Ctrl 1,and Ctrl 3 group,all the specimens formed homogeneous cartilagelike tissue with typical histological structure at different extent.In Ctrl 2 group,the specimens formed fiber-like tissue. Average wet weight and GAG content of specimens in Exp group were more than 88%of Ctrl 1 group while they were less than 40%in Ctrl 3 group.Cartilage lacuna was detected by HE staining in Exp,Ctrl 1 and Ctrl 3 group at different extent, but not in Ctrl 2 group.Collagen type II was detected by immunohistochemistry in Exp,Ctrl 1 and Ctrl 3 group at different extent,but not in Ctrl 2 group.ConclusionMicrotia chondrocytes could promote chondrogenesis of ADSCs in vivo under the co-culturing system.Tissue engineering cartilage by co-culturing microtia chondrocytes and ADSCs in vivo is feasible.

Co-culture;ADSCs;Microtia chondrocytes;In vivo

Q813.1+2

A

1673－0364（2011）02－0075－05

2011年2月26日；

2011年3月12日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.02.004

100144北京市中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院。

蔣海越（E－mail：jianghaiyue@sohu.com）