崔穎 崔志明 徐冠華 王玲玲 孫郁雨 儲驚蟄

PLGA與大鼠嗅鞘細胞的生物相容性研究

崔穎 崔志明 徐冠華 王玲玲 孫郁雨 儲驚蟄

目的觀察聚乳酸-乙醇酸聚合物［Poly(DL-lactic-co-glycolic acid)，PLGA］（LA∶GA=75∶25）與大鼠嗅鞘細胞的生物相容性。方法將分離提純的大鼠嗅鞘細胞接種于PLGA膜上，對照組以相同的細胞接種于多聚賴氨酸包被的圓玻片上。使用倒置顯微鏡、掃描電鏡觀察細胞的黏附和生長情況，并采用MTT法及熒光染色后電子圖像統(tǒng)計分析檢測支架對細胞的毒性。結果嗅鞘細胞接種于PLGA膜上后良好生長，S-100陽性細胞計數(shù)、胞體面積和細胞周長與對照組無顯著差異（P＞0.05）。結論PLGA聚合物與嗅鞘細胞生物相容性良好，有望用于脊髓損傷修復的組織工程研究。

嗅鞘細胞聚乳酸-乙醇酸聚合物生物相容性脊髓損傷

脊髓神經(jīng)組織工程中理想的支架材料應具有良好的生物相容性，無毒副作用。聚乳酸-乙醇酸共聚物[poly(DL-lactic-co-glycolic acid)，PLGA]是一種可降解的高分子有機化合物，由不同比例的乳酸（LA）與乙醇酸（GA）聚合而成，是一種較理想的神經(jīng)組織工程支架材料[1]。嗅鞘細胞（Olfactory ensheathing cells，OECs）是一種特殊的神經(jīng)膠質(zhì)細胞，它可以通過神經(jīng)營養(yǎng)、抑制膠質(zhì)增生和瘢痕形成、成鞘作用等促進損傷脊髓的修復[2-4]。本研究用大鼠OECs與LA∶GA=75∶25的PLGA膜進行體外共同培養(yǎng)，觀察PLGA與OECs的生物相容性。

1 材料與方法

1.1 材料

出生1～3 d的SD大鼠（南通大學醫(yī)學院實驗動物中心）；PLGA（LA∶GA=75∶25，IV=2.0 dl/g，濟南岱罡生物材料有限公司）；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司）；NGFRp75抗體（Santa Cruz公司）；Hoechst 33342、S-100抗體（Sigma公司）；Alexa fluor 568、Alexa fluor 488（Invitrogen公司）。

1.2 PLGA膜的制備和體外降解檢測

將PLGA溶于氯仿，配制成10%(w/v)的溶液，倒入模具中，液高為0.5 mm，待溶劑自然揮發(fā)，脫模后放入真空干燥機干燥成膜。PLGA膜用70%的乙醇滅菌，再用無菌生理鹽水清洗3次，經(jīng)紫外燈照射后無菌保存?zhèn)溆谩?/p>

將PLGA膜剪成2 cm×2 cm大小，電子天平稱重，然后將樣品膜浸泡于pH 7.2的PBS緩沖液中，放入37℃恒溫箱內(nèi)，每周換液。定期取樣，蒸餾水沖洗，干燥至恒重后稱重。最后將降解的PLGA膜表面噴金，在掃描電子顯微鏡下觀察其表面形態(tài)。重量損失公式如下，其中M1是降解前的質(zhì)量，M2是降解后的質(zhì)量。

1.3 原代OCEs的培養(yǎng)及純化

出生后1～3 d的SD大鼠腹腔麻醉后斷頭處死，無菌條件下分離雙側嗅球，置于DMEM/F12基礎培養(yǎng)液中。培養(yǎng)液清洗嗅球2次，用眼科彎剪剪碎嗅球成1 mm3的組織塊，加入0.125%胰酶置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中消化20 min。用毛細吸管反復吹打至懸液呈乳白色，用含10%胎牛血清（FBS）的完全培養(yǎng)液中止消化5 min。用400目不銹鋼篩網(wǎng)濾過后收取細胞懸液，1 000 r/min離心10 min，棄上清后加入培養(yǎng)液，吹打均勻，再次離心后棄上清，加入含10%FBS的完全培養(yǎng)液及青霉素100 U/mL、鏈霉素100 mg/mL，毛細吸管吹打制成單細胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)18 h和36 h后，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至另一培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)48 h后將細胞懸液吸至刻度離心管，離心后棄上清，加入完全培養(yǎng)液吹打均勻，臺盼藍染色計數(shù)。培養(yǎng)至第7天的OECs，用Hoechst 33342、S-100、NGFRp75特異性抗體作免疫熒光染色鑒定純度。

1.4 OECs與PLGA膜共同培養(yǎng)

將濃度為1×106cells/mL的純化OECs懸液接種于無菌PLGA膜上，對照組則將同樣的細胞接種于多聚賴氨酸（PLL）包被的圓玻片上。兩者均置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，每3天行半量換液，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。將與OECs共培養(yǎng)1 d、3 d、5 d、7 d的PLGA膜經(jīng)過浸洗、固定、脫水、干燥、表面噴金后行掃描電鏡觀察。

1.5 免疫熒光抗體標記

分別于培養(yǎng)第1、3、5、7天吸出培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定30 min，PBS緩沖液浸洗3次，封閉血清孵育1 h，加入兔抗大鼠NGFRp75與小鼠抗大鼠S-100一抗混合液4℃過夜，PBS緩沖液浸洗3次，加入Alexa fluor 568羊抗小鼠與Alexa fluor 488羊抗兔IgG混合液，室溫下作用2 h，封片，熒光顯微鏡觀察攝片。

1.6 OECs在PLGA膜上的細胞增殖能力檢測

共培養(yǎng)1 d、3 d、5 d、7 d后加入5 mg/mL MTT溶液，37℃孵育，再加入二甲基亞砜震蕩溶解結晶，用酶標儀測570 nm的OD值，計算細胞相對增殖率（RGR）。毒性分級標準如下：0%為Ⅴ級，1%～24%為Ⅳ級，25%～49%為Ⅲ級，50%～74%為Ⅱ級，75%～99%為Ⅰ級，≥100%為0級。RGR值越大，級數(shù)越低，則材料毒性越小。

1.7 圖像處理和統(tǒng)計分析

在放大200倍的熒光顯微鏡下，將攝取的照片導入圖像處理系統(tǒng)，應用捷達801系列形態(tài)學分析軟件，計數(shù)200倍視野內(nèi)S-100陽性細胞數(shù)，并通過圖像處理系統(tǒng)得到相應照片中S-100陽性細胞的胞體面積和細胞（包括突起）周長，每組均取3張切片的平均值作為統(tǒng)計數(shù)據(jù)，以均數(shù)±標準差表示，使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，P＜0.05表示差異有顯著性意義。

2 實驗結果

2.1 PLGA膜的體外降解檢測

PLGA膜在PBS中的質(zhì)量損失隨時間延長而增加（圖1），開始2周質(zhì)量損失較多，但前8周平均降解速度較慢，8周后降解速度加快，至第12周達到14%。電鏡下，PLGA膜表面逐漸皺縮并出現(xiàn)紋理（圖2）。

2.2 OECs的鑒定

Hoechst 33342、S-100、NGFRp75特異性抗體作免疫熒光染色，鑒定為OECs細胞，純度大于91%（圖3）。

2.3 OECs與PLGA膜共培養(yǎng)形態(tài)學觀察

OECs與PLGA膜共培養(yǎng)后，逐漸由懸浮狀態(tài)沉降到膜表面，并在膜上附著展開，至12 h后，約80%細胞已黏附，細胞呈圓形和橢圓形，突起少，胞體大，聚集成團。接種1 d后，細胞團的外圍細胞伸出短小突起，并向外周輻射散開，細胞團較共培養(yǎng)前面積增大。接種第3天，見細胞團擴散，大部分細胞生成突起，呈雙極或三極，以雙極為主。接種第5天，細胞在膜上遷移，分布均勻，突起伸長，出現(xiàn)多極細胞，并分泌較多細胞基質(zhì)。接種第7天，細胞密度增加，突起伸展，與對照組比較，在膜上遷移的距離較小，細胞較聚集，細胞數(shù)量和形態(tài)與對照組無明顯差異（圖4）。

2.4 細胞增殖能力

OECs與PLGA膜共培養(yǎng)，不同時間點的OD值見表1，細胞毒性評級為Ⅰ，顯示PLGA膜與OECs具有良好的相容性。

圖1 PLGA膜體外降解12周質(zhì)量損失曲線Fig.1Degrated curve of weight loss of PLGA membrane in 12 weeks in vitro

圖2 PLGA膜體外降解實驗掃描電鏡觀察（1 500×）Fig.2SEM observation of degradation of PLGA membrane(1 500×)

圖3 培養(yǎng)7 d的OECs（200×）Fig.3OECs 7 days after culture(200×)

圖4 掃描電鏡觀察（1 500×）：PLGA組培養(yǎng)1 d（A）、3 d（B）、5 d（C）、7 d（D）；對照組培養(yǎng)1 d（E）、3 d（F）、5 d（G）、7 d（H）Fig.4SEM observation(1 500×):PLGA group 1 d(A),3 d (B),5 d(C),7 d(D)after culture;control group 1 d(E),3 d (F),5 d(G),7 d(H)after culture

圖5 免疫熒光染色檢查（200×）Fig.5Immuno-fluorescent staining observation(200×)

2.5 免疫熒光檢測

S-100陽性細胞的數(shù)量、胞體面積和細胞（包括突起）周長與對照組相比無顯著性差異（P＞0.05）（表2、圖5）。

表1 兩組不同時間點的OD值（x±s，n=6）Table 1OD values of two groups in different time(x±s，n=6)

表2 兩組的S-100陽性細胞數(shù)、胞體面積和細胞周長比較（x±s，n=12）Table 2S-100 positive cell count,cell bodies area and cell circumference of two groups(x±s,n=12)

3 討論

脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復至今仍是困擾醫(yī)學界的難題，組織工程研究的發(fā)展為脊髓損傷的修復帶來了新的希望。OECs移植治療脊髓損傷已顯示出良好的應用前景，Raisman在其報道中較系統(tǒng)地提出OECs將是修復脊髓損傷最有應用前景的移植細胞。但單純移植細胞往往會造成移植細胞流失，以及移植區(qū)仍留有組織缺損而不利于神經(jīng)修復等不足，因此構建合適的細胞支架做為移植細胞的載體是保證移植成功的關鍵[5-6]。理想的脊髓組織支架材料應該具有良好的生物相容性、可靠的機械強度、生物可降解性、高孔隙率和三維立體結構，以及可塑性和表面生物活性等特點，其中首要的是具備良好的生物相容性[7-8]。

PLGA由不同比例的乳酸（LA）與乙醇酸（GA）聚合而成，在體內(nèi)通過酯鍵水解而使分子鏈斷裂，逐漸生成LA和GA單體，其機械性能、強度、親疏水性和降解速率等，均可以通過調(diào)節(jié)兩者的不同比例進行調(diào)整[9-10]。Moore等[11]將LA∶GA＝85∶15的PLGA多通道支架復合雪旺細胞移植入脊髓橫斷的大鼠體內(nèi)，1個月后有豐富的再生軸突通過了支架全長。Teng等[6]將兩種比例的PLGA制作的支架與神經(jīng)干細胞復合移植入大鼠半切脊髓中，亦發(fā)現(xiàn)移植后神經(jīng)功能得到明顯恢復。這些研究表明，PLGA可以作為多種種子細胞的載體。

由于GA單體比LA單體的降解速率快，所以PLGA膜的降解速率隨著GA比例的增大而增加。在各種比例的PLGA材料中，75∶25的降解速率較適中，因此我們選用此種比例的PLGA膜作為實驗對象。體外降解實驗顯示，75∶25的PLGA膜在開始2周快速降解，之后進入平臺期，第8周的降解速率緩慢，之后明顯加快，這與Wu等[12]的研究結果相似，但整體降解速率較其緩慢，可能是由于使用材料的物理形態(tài)不同所致。因為，Wu等使用的多孔隙的支架比本實驗使用的PLGA膜具有更大的接觸面積，與溶液的接觸面積越大，降解速率越快；另外，在體外實驗中，多孔支架降解后所產(chǎn)生的酸性物質(zhì)易聚集在支架孔隙內(nèi)，不能快速擴散入周圍溶液中，支架局部pH值的下降可以加速其降解。

支架材料的降解速率與脊髓組織修復的時間應能匹配。初始修復損傷脊髓時，移植的支架材料應具有足夠的力學強度以維持損傷區(qū)域的穩(wěn)定性，防止周圍組織塌陷，從而支持神經(jīng)軸突的延伸和局部組織的再生。隨著軸突生長，支架材料應快速的降解，從而為再生組織讓出空間，使其逐漸填充損傷區(qū)域，避免造成再生神經(jīng)和組織的壓迫。75∶25的PLGA材料在8周后快速降解的特性，符合大鼠脊髓損傷修復的時間規(guī)律，適合于大鼠脊髓損傷修復的研究。

多聚賴氨酸（PLL）可以通過改善培養(yǎng)皿的電荷狀況及吸附培養(yǎng)液成分促進細胞貼壁[13]，是目前公認的細胞培養(yǎng)的良好載體，因此我們選擇PLL與OECs共同培養(yǎng)作為對照組。本實驗中，PLGA膜與OECs共培養(yǎng)，通過倒置相差顯微鏡、掃描電鏡、免疫熒光等觀察顯示，PLGA組與對照組OECs的形態(tài)、數(shù)量和分布沒有顯著區(qū)別，S-100特異性抗體免疫熒光染色陽性細胞的數(shù)量、胞體面積和細胞周長與對照組無明顯統(tǒng)計學差異，表示OECs可以很好地在PLGA膜上黏附、生長和遷移。MTT檢測細胞增殖率的結果顯示在各時間點OECs在PLGA膜上的相對增殖率均在75%～99%之間，細胞毒性等級為Ⅰ級，表明PLGA對OECs無毒副作用。

體外復合細胞培養(yǎng)法研究生物材料的相容性可以直接觀察細胞與生物材料復合生長的情況，較為敏感、客觀。本實驗觀察到OECs能夠在75∶25的PLGA膜中存活、成熟和增殖，說明OECs與PLGA膜具有良好的生物相容性，從而表明OECs－PLGA膜復合物將有可能用于治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷或病變。

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Biocompatibility of PLGA with Olfactory Ensheathing Cells in Rat

CUI Ying,CUI Zhiming,XU Guanhua,WANG Lingling,SUN Yuyu,CHU Jingzhe.Department of Spine Surgery,Second Affiliated Hospital of Nantong University,Nantong 226001,China.Corresponding author:CUI Zhiming(E-mail：czmspine@163.com).

ObjectiveTo explore the biocompatibility of Poly(DL-lactic-co-glycolic acid)(PLGA)(LA∶GA=75∶25)with olfactory ensheathing cells(OECs)in rat.MethodsThe purified OECs were seeded on the PLGA membrane(PLGA group) and on the columns coated Poly-L-Lysine(control group).The adhesion and viability of OECs were observed by inverted microscope and scanning electron microscopy.MTT method and the computer image statistical software were used to determinate the survival and proliferation of OECs.ResultsOECs grew well on PLGA membrane.There were no significant differences in the activity of OECs.The number of S-100 positive cel1s,the area of the cell bodies and the perimeter of the cell between two groups（P＞0.05）.ConclusionThe PLGA biomaterial has good biocompatibility with rat OECs.It could be an ideal tissue engineered scaffold material in the repair of spinal cord injury.

Olfactory ensheathing cells;Poly(DL-lactic-co-glycolic acid);Biocompatibility;Spinal cord injury

Q813.1+1，R318.08

A

1673－0364（2011）02－0080－05

2011年1月19日；

2011年2月28日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.02.005

江蘇省“醫(yī)學重點人才”資助項目(RC2007027)，南通市社會發(fā)展科技計劃項目（S2009014）。

226001江蘇省南通市南通大學第二附屬醫(yī)院脊柱外科。

崔志明（E-mail：czmspine@163.com）。