程麗英 唐夢遙 金蓉 張艷 孫寶珊 施耀明 張余光

人參皂甙Rg3對兔耳增生性瘢痕的影響

程麗英 唐夢遙 金蓉 張艷 孫寶珊 施耀明 張余光

目的研究在創(chuàng)傷早期應用人參皂甙Rg3對兔耳增生性瘢痕形成的影響。方法建立12只新西蘭大耳白兔的增生性瘢痕模型。將兔耳創(chuàng)面分為6組：空白對照組（B組），生理鹽水注射組（T0組）以及治療組（T1～T4）。T1～T4各組于術后第2天開始在兔耳創(chuàng)面周圍皮膚皮下注射不同濃度Rg3，其中T1組1 mg/mL，T2組2 mg/mL，T3組3 mg/mL，T4組4 mg/mL；每處創(chuàng)面注射劑量為0.1 mL，每日1次。大體觀察創(chuàng)面愈合時間和瘢痕增生情況。術后4周在瘢痕處取材，行HE、Masson染色，測量各組的HI指數(shù)，計算膠原纖維密度；ELISA法測定VEGF含量；檢測各標本Hpr含量。結果T1～T4組HI較B組和T0組低（P＜0.05），T1～T4組間HI無差異（P＞0.05）；T1～T4組VEGF含量較B組和T0組低（P＜0.01），T1～T4組VEGF含量無差異（P＞0.05）；T1～T4組的膠原纖維密度低于B組和T0組（P＜0.05），T1～T4組膠原纖維密度無差異（P＞0.05）；T1～T4組Hpr含量較B組和T0組低（P＜0.05），T1～T4組Hpr含量無差異（P＞0.05）。結論在增生性瘢痕形成的早期階段，應用人參皂甙Rg3能減少瘢痕局部新生血管的生成，減少瘢痕組織中膠原的合成，從而減輕增生性瘢痕的形成。為應用人參皂甙Rg3治療增生性瘢痕提供了理論依據(jù)。

人參皂甙Rg3增生性瘢痕血管內皮生長因子羥脯氨酸

增生性瘢痕是創(chuàng)傷治療的一大難題。增生性瘢痕的產生分為3個階段：炎癥反應階段、增生性階段、塑形階段[1]。其病理機制尚不明確，目前認為增生性瘢痕的產生與以下因素有關：增強的炎癥反應，過多的細胞外基質的沉積，局部增強的血管化反應，減弱的細胞凋亡等[3]。增生性瘢痕的治療方法很多，主要是對增生和塑型階段的瘢痕進行治療，但均不能取得滿意的效果。我們嘗試在增生性瘢痕形成的早期階段對其進行干預，以預防增生性瘢痕的形成。

20-(R)人參皂甙Rg3是由人參中提取的一種單體成分，簡稱人參皂甙Rg3，能抑制血管內皮細胞的增殖，減弱新生毛細血管的生成，抑制血管內皮生長因子（VEGF）誘導的血管化作用等，從而能夠抑制過強的血管化反應[3]；另有報道認為，人參皂甙Rg3對人增生性瘢痕成纖維細胞的增殖具有明顯抑制作用，并能夠誘導其凋亡[4]。因此，我們推測在增生性瘢痕形成的早期，局部應用人參皂甙Rg3，可能具有預防或減弱增生性瘢痕形成的作用。本研究建立兔耳增生性瘢痕模型，觀察人參皂甙Rg3早期局部注射后兔耳創(chuàng)面的愈合情況和瘢痕增生情況，以及瘢痕組織細胞外基質構成的變化，為臨床應用人生皂甙Rg3防治瘢痕增生提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、主要儀器與試劑

健康清潔級新西蘭大耳白兔12只（上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院動物中心），體質量2.5～3 Kg，兔耳健全，雌雄不限，單籠飼養(yǎng)；人參皂甙Rg3純品（純度98.63%，大連富生制藥有限公司），用生理鹽水配制成濃度為1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/ mL、4 mg/mL的混懸液，現(xiàn)用現(xiàn)配，以漩渦振蕩器混勻；Tissue Protein Extraction Reagent（Thermo Scientific，美國）；Protease Inhibitor cocktail setⅠ（Calbiochem，美國）；BCA protein assay kit（Thermo Scientific，美國）；兔VEGF定量EIA試劑盒（RapidBio，美國）；酶標儀（Thermo labsystems，美國）；離心機（Beckman，美國）；熒光顯微鏡（Nikon，日本）；Image-Pro-Plus圖像分析軟件（Media Cybernnetics，美國）；羥脯氨酸測試盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 實驗方法

1.2.1 增生性瘢痕動物模型的建立

實驗兔飼養(yǎng)1周后，根據(jù)Morris等[5]和李薈元等[6]建立的瘢痕動物模型法，麻醉后，嚴格無菌操作下，分別于兔耳腹側面近、中、遠端水平的內外側（避開可見血管）各形成1個直徑1 cm的創(chuàng)面，每耳6個創(chuàng)面，間隔≥1 cm，建立兔耳增生性瘢痕模型。術中切除兔耳皮膚及軟骨膜，保留耳軟骨，壓迫止血。術后以乙醇和生理鹽水清潔創(chuàng)面。

1.2.2 實驗分組、標本取材及處理

將12只兔子隨機分為6組（n=2）?？瞻讓φ战M（B組）：術后不進行任何處理；生理鹽水注射組為（T0組）：術后第2天開始在兔耳創(chuàng)面周圍皮下注射生理鹽水；治療組：術后第2天開始在兔耳創(chuàng)面周圍皮下注射不同濃度人參皂甙Rg3，T1組為1 mg/mL，T2組為2 mg/mL，T3組為3 mg/mL，T4組為4 mg/mL。每處創(chuàng)面注射劑量為0.1mL，每日1次，持續(xù)28 d。大體觀察創(chuàng)面愈合和瘢痕增生情況。

術后4周，切取瘢痕組織標本，每個標本分為3份，1份標本以4%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，沿組織橫切面進行切片，行HE染色及masson染色；1份標本稱重，-80℃條件下保存，檢測VEGF含量；1份標本稱重，-80℃條件下保存，檢測羥脯氨酸（Hpr）的含量。

1.3 結果檢測

1.3.1 大體觀察

察創(chuàng)面愈合情況，術后28 d，觀察各組增生性瘢痕的硬度、色澤、形態(tài)。

1.3.2 鏡下觀察

常規(guī)HE染色：采集標本需包括瘢痕組織周邊5 mm的健康皮膚，4%中性甲醛固定24 h，乙醇脫水，石蠟包埋，沿瘢痕凸起最高點縱行切片，HE染色，鏡下觀察，低倍顯微標尺測量，計算瘢痕增生指數(shù)HI（HI是用來測量真皮層增生程度的指標）[5，7]，HI=瘢痕高度(SH)/健康皮膚高度(DH)。

膠原纖維密度：標本石蠟包埋、Masson染色，膠原纖維呈綠色，每個切片隨機選取5個視野，共15個視野，利用Image-ProPlus圖像分析軟件計算膠原纖維密度[8]。

1.3.3 瘢痕組織VEGF含量測定

將各組織標本稱重，根據(jù)組織塊大小加入適量的Tissue Protein Extraction Reagent和Protease Inhibitor（二者比例為100∶1），將組織塊減碎后勻漿、離心（10 000 r/min，30 min），提取樣本組織的總蛋白，用Bradford法測定所提樣本總蛋白的濃度，雙抗夾心ELISA法檢測各樣本中VEGF含量。步驟如下：于各反應板孔中加入100 μL相應的組織蛋白提取液，37℃溫育90 min；洗板，加入100 μL 1× Biotin，37℃溫育60 min；洗板，加入100 μL 1× HRP，37℃溫育30 min；洗板，每孔加入50 μL顯色液A和50 μL顯色液B，37℃暗處溫育20 min；每孔加入100 μL終止液，輕輕混勻后立刻酶標儀讀取OD450值。根據(jù)標準曲線及各孔OD450值算出相應標本中VEGF濃度（VEGF在總蛋白中的濃度=相應標本中VEGF濃度/該標本的總蛋白濃度）。

1.3.4 瘢痕組織羥脯氨酸（Hpr）含量測定

將各組標本稱重，經水解、調節(jié)pH值、蒸餾水稀釋、加活性炭混勻離心，測定吸光度，計算羥脯氨酸的含量。

1.5 統(tǒng)計學處理

所得數(shù)據(jù)用SAS軟件包進行單因素方差分析，以“x±s”表示。P＜0.05表示差異具有顯著性。

2 結果

2.1 大體觀察

各組創(chuàng)面均愈合良好，無感染。B組、T0組和T1～T4組的創(chuàng)面愈合時間分別為（18.75±1.42）d、（18.67±1.23）d、（18.17±1.64）d、（18.5±1.45）d、（17.75±1.60）d、（18.25±1.42）d，各組間無顯著性差異（P＞0.05）。術后4周可見B組和T0組形成的增生性瘢痕最為顯著，瘢痕呈圓形，中央“小丘”樣凸起，色紅、質硬，增生范圍不超過創(chuàng)緣；T1～T4組與前兩組比較，瘢痕增生程度較輕，色澤明顯較淺，表面較平坦，質較軟（圖1）。

2.2 組織學變化

B組和T0組瘢痕組織真皮層明顯增厚，為周邊正常真皮層厚度的2～3倍，真皮層可見毛細血管、大量成纖維細胞增殖，膠原纖維多，排列紊亂，致密而粗大，可見旋渦狀結構和膠原結節(jié)，結構近似增生性瘢痕組織。與B組和T0組相比，T1～T4組真皮層厚度明顯較薄，成纖維細胞數(shù)量減少，膠原纖維致密度下降，膠原纖維束間有較大的空隙，排列較規(guī)則，呈多層水平向排列，新生血管、漩渦結節(jié)和膠原結節(jié)明顯減少（圖2）。

2.3 瘢痕組織VEGF含量

T1～T4組的VEGF含量較B組和T0組顯著降低（P＜0.05），B組與T0組VEGF含量無差異（P＜0.05），T1～T4各組之間的VEGF含量無差異（P＜0.05）（圖3）。

2.4 瘢痕增生指數(shù)HI

B組、T0組、T1～T4組HI值分別為2.04±0.08、2.06±0.07、1.76±0.09、1.74±0.06、1.72±0.11和1.72±0.13，B組與T0組的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），T1～T4組的HI指數(shù)較B組及T0組低（P＜0.05），T1～T4組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.5 膠原纖維密度

B組和T0組之間膠原纖維密度無顯著性差異（P＞0.05），T1～T4組較B組和T0組明顯降低（P＜0.05），T1～T4組之間膠原纖維密度無顯著性差異（P＞0.05）（圖4）。

2.6 瘢痕組織Hpr的測定

B組與T0組之間無差異（P＞0.05），T1～T4組的Hpr值均小于B組和T0組（P＜0.05）；T1～T4組之間無差異（P＞0.05）。

圖1 術后4周時兔耳增生性瘢痕大體觀察Fig.1Gross observation of each group 4 weeks after operation

圖2 組織學觀察（HE，100×）Fig.2Histological observation(HE,100×)

圖3 術后4周各組VEGF含量比較Fig.3VEGF content of each group 4 weeks after operation

圖4 組織學觀察（Masson，400×）Fig.4Histological observation(Masson,400×)

3 討論

增生性瘢痕的發(fā)生機制至今仍未明確，目前認為主要與異常的細胞反應、細胞外生長因子（PDGF、TGF-β和VEGF）的過度表達導致成纖維細胞的過度增殖、局部血管化反應的過度增強、膠原纖維合成的增加及異常沉積等有關。另外，基質金屬蛋白酶（MMP）活動性的減弱導致膠原降解減弱，Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白的比例異常，也是增生性瘢痕形成的重要病理機制[1]。目前的治療方法主要有類固醇激素、抗代謝藥物、免疫抑制劑、放射療法和硅膠膜、手術切除等[9]，但均未達到滿意的效果。

人參皂甙Rg3是從人參中提取的一種單體成分，近年來國內外學者對其進行了廣泛深入的研究，發(fā)現(xiàn)人參皂甙Rg3能抑制血管內皮細胞的增殖、減弱新生毛細血管的生成、抑制VEGF誘導的血管化作用，從而可抑制新生血管的過度形成[3]；人參皂甙Rg3還具有抗腫瘤作用，能誘導多種腫瘤細胞的凋亡[10-11]，且對骨髓、心、肺、肝、腎和神經系統(tǒng)無毒副作用[12]。劉鶴松等[4]發(fā)現(xiàn)人參皂甙Rg3對人增生性瘢痕的成纖維細胞增殖有明顯的抑制作用，并能夠誘導其凋亡。在增生性瘢痕形成的早期階段應用人參皂甙Rg3，可能具有預防或者減輕瘢痕形成的作用，因此我們應用兔耳增生性瘢痕模型對其進行了研究，從組織病理學、VEGF含量、膠原纖維、羥脯氨酸含量的變化等角度研究人參皂甙Rg3局部應用對增生性瘢痕的作用。

T1～T4組的創(chuàng)面愈合時間與B組、T0組比較，差異無統(tǒng)計學意義，說明局部應用人參皂甙Rg3不會延遲創(chuàng)面愈合。T1～T4組與B組、T0組比較，瘢痕增生程度減輕，色澤明顯較淺，表面明顯平坦，質較軟。

HI是表示瘢痕的增生情況及治療效果的指標[5]，T1～T4組HI指數(shù)低于B組和T0組，說明在瘢痕形成早期應用人參皂甙Rg3有效減輕了增生性瘢痕的形成；鏡下觀察T1～T4組新生血管少于B組和T0組；T1～T4組VEGF含量顯著低于B組和T0組，表明早期應用人參皂甙Rg3能抑制兔耳增生性瘢痕中新生血管的形成，從而有望抑制瘢痕形成。Hpr是合成動物膠原蛋白的特有氨基酸，檢測其變化可以反映膠原合成情況。本實驗結果顯示，T1～T4組的Hpr含量低于B組和T0組，以T4組最低。Masson染色結果發(fā)現(xiàn)，T1～T4組的膠原纖維較B組和T0組的排列更整齊、更疏松，其膠原纖維密度較B組和T0組低。以上結果均表明，早期應用人參皂甙Rg3能抑制兔耳增生性瘢痕中膠原的合成，改善瘢痕組織細胞外基質構成，使其更接近正常皮膚；T1～T4組間的以上各測量指標差異無統(tǒng)計學意義，說明人參皂甙Rg3抑制瘢痕形成的作用，并未隨濃度升高而增加，可能與人參皂甙Rg3飽和溶解度較低有關。

本實驗結果初步顯示在兔耳瘢痕形成的早期階段局部應用人參皂甙Rg3，可以減輕增生性瘢痕的形成，推測其可能通過以下途徑抑制瘢痕增生：①抑制VEGF誘導的局部新生血管的形成，抑制過強的血管化反應；②直接抑制瘢痕成纖維細胞的生長增殖或誘導其凋亡，從而抑制成纖維細胞增殖，減少膠原的合成和分泌。兩者中以抑制VEGF誘導的局部新生血管形成為主要作用機制。

本實驗結果僅是一個初步的探索，人參皂甙Rg3真正應用于臨床，尚需在劑量、給藥途徑等多方面進行更為深入的研究。

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Effets of Ginsenoside Rg3 on the Hypertrophic Scar of Rabbit Ears

CHENG Liying,TANG Mengyao,JIN Rong, ZHANG Yan,SUN Baoshan,SHI Yaoming,ZHANG Yuguang.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author: ZHANG Yuguang(E-mail:zhangyg16@126.com).

ObjectiveTo investigate the effets of Ginsenoside Rg3 on the hypertrophic scar of rabbit ears in the early phase of scarring.MethodsThe rabbit ear model was established on the 12 New Zealand white rabbits.The rabbits were divided into 6 groups(n=2):group B(control group),group T0(only NS),group T1(GS-Rg3 1 mg/mL),group T2(GSRg3 2 mg/mL),group T3(GS-Rg3 3 mg/mL),group T4(GS-Rg3 4 mg/mL).0.1 mL GS-Rg3 with different concentration were injected at wound in each group from 1 day after operation.The wounds healing times and hypertrophic scar were observed.Scar samples were harvested 28 days after operation.The calculation of HI index and collagen density by HE, Masson staining,VEGF content was detected by ELISA and Hpr content was also detected.ResultsThe expression of VEGF,HI index,collagen density and the Hpr content were significantly lower in group T1－T4 compared with group B and group T0(P＜0.05).There were no significantly differences between group T1-T4.ConclusionTopical injection of ginsenoside Rg3 in the early phase of trauma can inhibit the activity of angiogenesis and the formation of collagen in a rabbit ear model,thus reduced hypertrophic scar formation.The findings of this study may have clinical implications on the management of human hypertryphic scars.

Ginsenoside Rg3;Hypertrophic scar;VEGF;Hpr

R619+.6

A

1673－0364（2011）02－0096－04

2011年1月22日；

2011年3月15日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.02.009

200011上海市上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院整復外科。

張余光（E-mail:zhangyg16@126.com）。