何竑超 李偉 竇紅靜 王曉晶 劉偉 孫康 沈周俊

泌尿系統(tǒng)組織工程支架材料膠原蛋白-殼聚糖及聚乙烯醇-絲膠的生物相容性評價

何竑超 李偉 竇紅靜 王曉晶 劉偉 孫康 沈周俊

目的評價復合材料膠原蛋白-殼聚糖、聚乙烯醇-絲膠作為泌尿系統(tǒng)組織工程支架的生物相容性和生物安全性。方法采用溶血實驗評價膠原蛋白-殼聚糖、聚乙烯醇-絲膠兩種復合材料對紅細胞功能和代謝的影響；采用皮膚致敏實驗評價兩種材料是否滿足體內植入的要求；采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法評價膠原蛋白-殼聚糖、聚乙烯醇-絲膠兩種復合材料對泌尿上皮細胞和膀胱平滑肌細胞的生長和增殖的影響。結果膠原蛋白-殼聚糖和聚乙烯醇-絲膠的溶血率分別為1.86%和2.08%（均＜5%），兩種材料不引起溶血反應。與陰性對照組相比，兩種材料皮膚致敏實驗的結果均為陰性，沒有致敏作用。細胞毒性實驗（四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法）顯示兩種材料細胞毒性均為0級。結論復合生物材料膠原蛋白-殼聚糖、聚乙烯醇絲膠具有良好的生物相容性，有望作為組織工程支架材料，應用于泌尿系統(tǒng)的修復重建。

膠原蛋白-殼聚糖聚乙烯醇-絲膠生物相容性組織工程

目前，對泌尿系統(tǒng)肌性管腔的修復主要采用自體器官替代的方法，但這種方法破壞了自身其他器官的完整性和連續(xù)性，而產生一系列不可避免的并發(fā)癥[1－2]。因此，組織工程技術成為未來泌尿系統(tǒng)修復重建的重要手段和發(fā)展方向。組織工程學是應用細胞生物學、材料科學和醫(yī)學生物工程學的基本原理，將體外培養(yǎng)擴增后具有生物學活性及特定功能的細胞與支架材料復合，以修復及重建組織缺損，繼而恢復組織或器官的部分或全部功能[3]。支架材料是組織工程研究的核心內容之一。本實驗按照有關生物安全性檢驗標準，對天然復合材料膠原蛋白-殼聚糖和人工合成高分子復合材料聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol，PVA）-絲膠進行相關檢測，以探討其作為泌尿系統(tǒng)組織工程支架的生物相容性和生物安全性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康雄性新西蘭大白兔12只（上海交通大學醫(yī)學院動物中心提供），2.0～2.4 Kg。其中，3只用于尿路上皮細胞及膀胱平滑肌細胞的培養(yǎng)和擴增，另9只分為3組，用于皮膚致敏實驗。

1.2 實驗材料

膠原蛋白-殼聚糖、PVA-絲膠由上海交通大學材料學院研制提供。

1.3 尿路上皮細胞、膀胱平滑肌細胞的培養(yǎng)和擴增

參照文獻[4]的方法進行。

1.4 材料浸提液制備

浸提介質為0.9%生理鹽水（按浸提介質∶樣品表面積=1 mL∶3cm2），溶血實驗中浸提介質于37℃浸提1 h；致熱源實驗、皮膚致敏實驗中浸提介質37℃浸提48 h，0.22 μm微孔濾器濾過除菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 溶血實驗

試管中加入實驗樣品浸提液0.2 mL、測試用紅細胞懸液0.2 mL和生理鹽水0.6 mL，混合均勻，37℃水浴60 min，750 r/min離心5 min，取上清液，545 nm波長測吸光度。以0.9%生理鹽水為陰性對照，蒸餾水為陽性對照。每組設平行樣品5個。根據公式計算材料的溶血率，當陰性對照組的吸光度＜0.03，陽性對照組的吸光度=（0.8±0.30）時實驗有效，實驗樣品的溶血率≤5%時，可判斷樣品不具溶血作用。

1.6 皮膚致敏實驗

取浸提液、0.9%生理鹽水（陰性對照）分別與弗氏完全佐劑等體積混合、充分混勻。在兔子的去毛區(qū)域作6點對稱皮內注射，每個點相距10～20 mm。皮內注射1周后，用已經在浸提液、陰性對照液中浸泡至飽和的2 cm×4 cm大小濾紙黏附于注射局部，封閉固定48 h。2周后，再用在浸提液、陰性對照液中浸泡至飽和的濾紙黏附，封閉保留24 h。將濾紙取下后分別于1 h、24 h和48 h觀察黏附處的紅斑和水腫反應。按照致敏反應評分標準，即無紅斑和水腫為0分，輕度紅斑和水腫為1分，明顯紅斑和水腫為2分，中度紅斑和水腫（直徑＜1 mm）為3分，重度紅斑或輕度焦痂和嚴重水腫（直徑＞1 mm）為4分，計算致敏反應率，并對實驗樣品進行評價。

1.7 細胞毒性實驗

取體外培養(yǎng)的第3代的尿路上皮細胞（圖1）以2×107cells/L的濃度接種于96孔培養(yǎng)板內，每孔加200 μL的無血清角質細胞培養(yǎng)液（KSFM，Gibco公司）培養(yǎng)，放入5%CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)液，各孔分別加入200 μL實驗樣品（膠原蛋白-殼聚糖、PVA-絲膠）浸提液，每種實驗樣品加5孔，陰性對照為KSFM培養(yǎng)液200 μL，再放入培養(yǎng)箱內。24 h、72 h、120 h后各取出1塊培養(yǎng)板，每孔加四甲基偶氮唑鹽（MTT，Sigma公司）20 μL，4 h后加二甲基亞砜（DMSO）200 μL，酶聯免疫檢測儀490 nm下測定吸光度。相同方法，進行實驗樣品與第3代膀胱平滑肌細胞（圖2）的毒性實驗，培養(yǎng)液及陰性對照為DMEM培養(yǎng)液。按照公式計算細胞相對增殖度，按6級毒性分級法計算毒性[5－6]。

圖1 第3代泌尿上皮細胞（倒置顯微鏡，40×）Fig.1Morphology observation of the 3rdpassage of urothelial cells(Inverted phase contrast microscope,40×)

圖3 第3代膀胱平滑肌細胞（倒置顯微鏡，40×）Fig.3Morphology observation of the 3rdpassage of bladder smooth muscle cells(Inverted phase contrast microscope,40×)

2 結果

2.1 溶血實驗

陰性對照組的吸光度為（0.014±0.001）（＜0.03），陽性對照組的吸光度為（0.832±0.018）（在0.8±0.30的范圍內），表明實驗有效。實驗樣品膠原蛋白-殼聚糖和PVA-絲膠的溶血率分別為1.86%和2.08%，均≤5%，表明兩種材料體外實驗無明顯溶血反應（表1）。

2.2 皮膚致敏實驗

復合材料膠原蛋白-殼聚糖、PVA-絲膠與陰性對照組的實驗結果相比無明顯差異，表明兩種材料在本實驗條件下未表現出致敏作用（表2）。

2.3 細胞毒性實驗

采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法，細胞為體外培養(yǎng)的第3代尿路上皮細胞和第3代膀胱平滑肌細胞。結果顯示，兩種材料的細胞毒性均為0級（表3、4）。

表1 溶血實驗結果Table 1The results of hemolytic

表2 皮膚致敏實驗結果Table 2The results of skin sensitization test

表3 膠原蛋白-殼聚糖、PVA-絲膠與泌尿上皮細胞毒性實驗結果Table 3The results of MTT assay of the collagen-chitosan and polyvinyl alcohol-sericin on the urothelial cells

表4 膠原蛋白-殼聚糖、PVA-絲膠與膀胱平滑肌細胞毒性實驗結果Table 4The results of MTT assay of the collagen-chitosan and polyvinyl alcohol-sericin on the bladder smooth muscle cells

3 討論

泌尿系統(tǒng)組織工程支架材料主要有3種：①天然材料，如異種膠原和殼聚糖等；②人工合成材料，如聚乙醇酸（PGA）、聚乳酸（PLA）等；③脫細胞基質，如膀胱黏膜下脫細胞基質（BAMG）和小腸黏膜下脫細胞基質（SIS）等[7－8]。Atala等[9]采用BAMG支架治療脊髓膜膨出伴膀胱功能異常取得成功；徐月敏等[10]成功使用脫細胞基質修復復雜、長段尿道狹窄。但與天然材料和人工合成材料相比，脫細胞基質并無優(yōu)勢，首先脫細胞基質取材較為復雜，且不能重復性大規(guī)模生產，另外機械特性和理化性狀無法調控。

膠原蛋白和殼聚糖是組織工程常用的材料。單純的膠原蛋白物理強度差、降解速度快[11]；單純的殼聚糖材料脆性較大、細胞黏附性低[12]。因此，我們將膠原蛋白與殼聚糖按9∶1比例共混，以冷凍干燥法制備膠原蛋白-殼聚糖支架。該支架為三維多孔結構，孔徑在100～300 μm之間，孔徑率達95%以上，且孔隙之間相互連通，有利于細胞的黏附增殖和營養(yǎng)成分的滲透。純絲膠在水中的溶失率大、力學性能較差，難以直接作為醫(yī)用材料使用，而PVA則具有良好的成膜性和較高的強度[13]。我們采用冷凍-解凍法制備PVA-絲膠支架，PVA與絲膠的比例為1∶1。

溶血實驗的目的是通過樣品在體外與血液直接接觸，測定紅細胞釋放的血紅蛋白量以評價材料對紅細胞功能和代謝的影響。根據我國GB/T16886-2001醫(yī)療器械生物學評價標準，非直接接觸血液的醫(yī)用生物材料的溶血率應＜5%。本實驗中，膠原蛋白-殼聚糖和PVA-絲膠的溶血率分別為1.86%和2.08%，表明兩種材料不引起溶血反應，能滿足醫(yī)用生物材料的應用要求。皮膚致敏實驗是將一定量實驗樣品或其浸提液與實驗動物皮膚接觸，以檢測實驗樣品引起皮膚致敏反應的可能性。結果表明，膠原蛋白-殼聚糖、PVA-絲膠兩種材料滿足體內植入的要求。四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法可檢測實驗樣品對細胞造成的毒性損害程度，對材料的細胞毒性進行定量評價。實驗表明，復合材料膠原蛋白-殼聚糖、PVA-絲膠和泌尿上皮細胞、膀胱平滑肌細胞具有良好的細胞相容性。

本實驗結果顯示，兩種復合生物材料無細胞毒性，生物相容性良好，有望成為較理想的泌尿系統(tǒng)組織工程支架材料。

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Biocompatibility Evaluation of Collagen-Chitosan and Polyvinyl Alcohol-Sericin as Tissue Engineered Scaffold in Urinary System

HE Hongchao1,LI Wei2,DOU Hongjing2,WANG Xiaojing1,LIU Wei3,SUN Kang2,SHEN Zhoujun1.1 Department of Urology,Ruijin Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200025,China;2 School of Materials Science and Engineering and Institute of Composite Materials,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200240, China;3 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:SHEN Zhoujun(E-mail:shenzj6@sina.com);SUN Kang (E-mail:ksun@sjtu.edu.cn).

ObjectiveTo investigate the biocompatibility of collagen-chitosan and polyvinyl alcohol-sericin as tissue engineered scaffold in urinary system.MethodsHemolytic test was performed to evaluate these materials′(collagenchitosan and polyvinyl alcohol-sericin)impact on the function and metabolism of erythrocyte.Skin sensitization test was used to investigate the feasibility of these materials as the implantation materials for human body.Cytotoxicity test(MTT assay)was used to evaluate these materials′influence on the growth and proliferation of cultured cells(urothelial cells and bladder smooth muscle cells).ResultsThe hemolytic rate of collagen-chitosan and polyvinyl alcohol-sericin was 1.86%and 2.08% respectively(＜5%),and no hemolytic effect was observed.Skin sensitization test showed no difference between experimental groups(collagen-chitosan group and polyvinyl alcohol-sericin group)and control group,which indicated that these materials meet the requirements of implantation.The MTT assay showed that cytotoxicity score of collagen-chitosan and polyvinyl alcohol-sericin were both grade 0.ConclusionBoth of collagen-chitosan and polyvinyl alcohol-sericin have good biocompatibility and should be safe and promising in urinary reconstruction as tissue engineered scaffold.

Collagen-chitosan;Polyvinyl alcohol-sericin;Biocompatibility;Tissue engineering

Q813.1+1，R318.08

A

1673－0364（2011）02－0089－04

2011年2月20日；

2011年3月21日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.02.007

上海交通大學醫(yī)工（理）交叉重點項目（YG2009ZD202）。

200025上海市上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院泌尿外科（何竑超，王曉晶，沈周?。?00240上海市上海交通大學材料科學與工程學院，上海交通大學復合材料研究所（李偉，竇紅靜，孫康）；200011上海市上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院整復外科（劉偉）。

沈周俊（E-mail：shenzj6@sina.com）；孫康（E-mail：ksun@sjtu.edu.cn）。