張春,凡星,沙莉娜,康厚揚(yáng),張海琴,周永紅,3＊

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都科學(xué)研究院小麥研究所,四川 成都611130;2.瀘州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,四川 瀘州646000;3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)作物基因資源與遺傳改良教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 雅安 625014)

廣義披堿草屬(Elymus)是禾本科(Poaceae)小麥族(Triticeae)中最大的多年生屬,全世界共有150余種。許多種類為優(yōu)良牧草,有些物種具有麥類作物抗病和抗逆的優(yōu)良基因,常被作物育種學(xué)家選作大麥和小麥遠(yuǎn)緣雜交的對(duì)象,把優(yōu)異的基因轉(zhuǎn)移到栽培的大麥和小麥中[1]。因此,作為豐富麥類作物和牧草遺傳多樣性的基因資源,這些屬具有重要的研究意義。按L?ve[2]和Dewey[3]基于染色體組的分類處理,廣義披堿草屬包括了形態(tài)上每穗軸節(jié)上著生一至多個(gè)小穗,穎呈披針形或卵狀披針形,每個(gè)小穗含多枚小花,自花傳粉的多年生物種。在這個(gè)屬的定義下,披堿草屬(Elymus)、鵝觀草屬(Roegneria)、猬草屬(Hystrix)、裂穎草屬(Sitanion)和仲彬草屬(Kengyilia)均包括在廣義披堿草屬當(dāng)中。

披堿草屬是以老芒麥(Elymussibiricus)作為模式種建立的,約含有20～30個(gè)物種,主要分布于歐亞大陸,南北美洲及大洋洲[4]。該屬中多異源四倍體或六倍體物種,具有StH、StYH、StYW等染色體組[2-4]。鵝觀草屬是以高加索鵝觀草(Roegneria caucasica)為模式種建立的,約有120種,主要分布于北半球的溫寒地帶[5],為四倍體和六倍體物種,大多具有StY染色體組組成[4]。許多學(xué)者建議將鵝觀草屬歸入披堿草屬當(dāng)中[2,3,6],但是我國(guó)學(xué)者在鵝觀草屬與披堿草屬上做了大量、細(xì)致的研究,認(rèn)為把鵝觀草屬單獨(dú)建屬更適合[7,8]。仲彬草屬是以戈壁灘仲彬草(Kengyilia gobicola)為模式種建立的,含有StYP染色體組[9]。其形態(tài)介于鵝觀草屬和冰草屬(Agopyron)之間[10]。L?ve[2]和Jensen[11]將該類植物放在披堿草屬中,而耿以禮和陳守良[7]將它們放入鵝觀草屬中。Yang等[12]則把它們組合到仲彬草屬中。猬草屬是以猬草(Hystrix patula)作為模式種建立的,其形態(tài)上具穎強(qiáng)烈退化甚至缺失的特點(diǎn)[13],由于其模式種具有StH染色體組,L?ve[2]和Dewey[3]將其處理到披堿草屬中。但是,目前的研究結(jié)果認(rèn)為該屬中的一些物種如:加拿大猬草(H.cali fornica)、H.duthiei和長(zhǎng)芒猬草(H.duthiei ssp.longearistata)具有與賴草屬(Leymus)相同的NsXm染色體組,使得其分類更為復(fù)雜[14,15]。裂穎草屬是以大松鼠尾巴草(Sitanion hystrix)為模式種建立的,具錐狀穎片,延伸成為較長(zhǎng)的芒,小花逐節(jié)脫落的特征[16]。許多種間及屬間雜交的結(jié)果表明,裂穎草屬物種具有StH染色體組組成[2,3,17],L?ve[2]將其劃入披堿草屬當(dāng)中作為裂穎草組(Section Sitanion)來(lái)處理。因此,披堿草屬、鵝觀草屬、猬草屬、裂穎草屬和仲彬草屬在系統(tǒng)地位、屬內(nèi)等級(jí)劃分及物種界限上還存在爭(zhēng)論,其爭(zhēng)論的焦點(diǎn)在于將它們歸入披堿草屬中,還是將其劃分為獨(dú)立的屬來(lái)處理[2,3,7,8,11]。

廣義披堿草屬為St染色體組與Y、H、W及P等小麥族多年生物種中的基本染色體組組合構(gòu)成的異源多倍體屬[2-4],其St染色體組來(lái)源于擬鵝觀草屬(Pseudoroegneria)[2,3]。目前,關(guān)于擬鵝觀草屬St染色體組在廣義披堿草屬物種中的具體供體種仍不清楚。Dewey[18]闡明了北美披堿草的St染色體組來(lái)源于北美的擬鵝觀草屬二倍體物種。而分布于亞洲的擬鵝觀草屬二倍體物種,如黎巴嫩擬鵝觀草(P.libanotica)、托瑞擬鵝觀草(P.tauri)等則參與了亞洲物種的起源[19]。Sun等[20]根據(jù)細(xì)胞核RPB2基因的研究結(jié)果,認(rèn)為穗狀擬鵝觀草(P.spicata)和糙緣擬鵝觀草(P.stipi folia)是披堿草屬物種的St染色體組供體,而黎巴嫩擬鵝觀草則可能沒有參與披堿草屬物種的形成。Stebbins和Pun[21]根據(jù)二倍體擬鵝觀草物種的種間雜種花粉母細(xì)胞配對(duì)數(shù)據(jù)和育性分析結(jié)果,首次提出了St染色體組在不同的二倍體物種間存在變異(如:St1St1、St2St2等),具有一定程度的分化。Mason-Gamer和Kellogg[22]對(duì)Waxy基因的外顯子序列進(jìn)行分析,認(rèn)為擬鵝觀草屬物種非單系起源。因此,具體是擬鵝觀草屬中的哪一個(gè)或哪幾個(gè)物種充當(dāng)了廣義披堿草屬物種形成時(shí)的二倍體供體,以及St染色體組的分化問題尚需進(jìn)一步探討。

根據(jù)葉綠體rpoA、trnL-F、ndhF等基因序列分析的結(jié)果,表明具有St染色體組的小麥族異源多倍體物種的母本供體均為St染色體組[23-25]。然而,顏濟(jì)等[26]根據(jù)核型研究結(jié)果,具StYP染色體組成的仲彬草屬物種其隨體出現(xiàn)在4P和6P染色體上,認(rèn)為仲彬草屬物種是由冰草屬二倍體物種(P染色體組)作為母本與鵝觀草屬四倍體物種(StY染色體組)作為父本雜交后加倍形成。因此,廣義披堿草屬植物的母本來(lái)源目前還存在爭(zhēng)議。

隨著PCR和DNA測(cè)序技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展,分子數(shù)據(jù)為植物系統(tǒng)學(xué)研究提供了豐富而翔實(shí)的資料,成為解決系統(tǒng)與進(jìn)化方面的一個(gè)十分重要的技術(shù)手段。越來(lái)越多的研究者正選擇合適的DNA序列用于研究小麥族異源多倍體植物的染色體組成及其起源與進(jìn)化歷史[20,22-25,27]。葉綠體基因組由于其序列為單拷貝,大多數(shù)被子植物中是母系遺傳,通常用于推斷雜交物種形成中的母系來(lái)源[23,25]。葉綠體trnL(UAA)-trnF(GAA)基因片段包括了2段外顯子,1段內(nèi)含子和1段基因間隔區(qū),由于其適中的進(jìn)化速率已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于研究小麥族植物雜種形成的系統(tǒng)發(fā)育研究,特別是用來(lái)探討多倍體物種的母本起源,也可在一定程度上揭示相關(guān)物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[23-25]。本研究通過(guò)對(duì)34份廣義披堿草屬物種和其相關(guān)二倍體物種的葉綠體trnL-F的序列進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)分析,目的在于:1)探討披堿草屬、鵝觀草屬、猬草屬、裂穎草屬和仲彬草屬間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系;2)揭示廣義披堿草屬物種的母本染色體組來(lái)源;3)探討廣義披堿草屬物種中St染色體組的來(lái)源及其分化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究選取了34份四倍體及六倍體廣義披堿草屬植物材料,含有StY、StH、StStY、StYP、StYH、StYW 及NsXm染色體組組成;14份二倍體物種材料包括來(lái)自于歐洲、亞洲及北美的5份擬鵝觀草屬材料(St染色體組)、3份大麥屬(Hordeum)材料(H染色體組)、2份南麥屬(Australopyrum)材料(W 染色體組)、2份冰草屬材料(P染色體組)、2份新麥草屬(Psathyrostachys)材料(Ns染色體組)。選取扁穗雀麥(Bromus catharticus)作為外類群。所有材料的序號(hào)、物種名稱、采集編號(hào)、來(lái)源及GenBank注冊(cè)號(hào)列于表1。PI編號(hào)的材料種子由美國(guó)國(guó)家植物種質(zhì)庫(kù)(American National Plant Germplasm System,Pullman,Washington,USA)提供,其余的由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所提供,由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所顏濟(jì)教授和楊俊良教授鑒定,憑證標(biāo)本藏于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所標(biāo)本室(SAUTI)。

表1 供試材料Table 1 The materials used in this study

續(xù)表1 Continued

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總DNA的提取純化及測(cè)序 2006年9月,將所有材料的種子置于25℃發(fā)芽,每份材料分別取約1 g新鮮葉片,液氮中研磨至粉末狀,放入1.5 mL離心管中,采用CTAB法[28]提取總DNA。trnL-F序列使用Taberlet等[29]設(shè)計(jì)的通用引物進(jìn)行高保真 PCR擴(kuò)增。其序列為:c(5′-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3′)和 f(5′-AT TTGAACTGGTGACACGAG-3′)。PCR反應(yīng)總體系 25 μ L,包括 10 ×反應(yīng)緩沖液 2.5 μ L,MgCl21.5 mmol/L,dNTP 200 μ mol/L,引物 1 μ mol/L,20～40 ng DNA 模版,Ex Taq酶0.5 U(中國(guó)大連 TaKaRa公司)。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性4 min;94℃變性40 s,60℃退火50 s,72℃延伸2 min,25個(gè)循環(huán);最后72℃延伸8 min。擴(kuò)增反應(yīng)在GeneAmp PCR System 9700(美國(guó)加利福尼亞州 Applied Biosystems公司)擴(kuò)增儀上進(jìn)行。PCR產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠上電泳,條帶分離后,用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(美國(guó)喬治亞州Omega公司)對(duì)其進(jìn)行回收、純化。純化后的PCR產(chǎn)物送到北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。所有材料均采用相同方法重復(fù)測(cè)序1次,2次測(cè)序結(jié)果完全相同后,將測(cè)序結(jié)果登錄到GenBank中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

1.2.2 序列分析 trnL-F序列邊界的劃定參照NCBI上登錄序列。用Clustal軟件[30]進(jìn)行對(duì)位排列后再進(jìn)行手工校正。trnL-F序列的核苷酸多態(tài)性估計(jì)及基因中性檢測(cè)采用DnaSp 4.0[31]完成;堿基組成及替代用MEGA v.3.0[32]進(jìn)行。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析及網(wǎng)狀進(jìn)化分析 trnL-F序列采用最大簡(jiǎn)約法(maximum parsimony,MP)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用PAUP＊4.0B10[33]軟件包完成。最大簡(jiǎn)約法分析采用啟發(fā)式搜索(Heuristic),分支交換算法采用樹對(duì)分重接(tree bisection-reconnection,TBR)法,100次隨機(jī)添加替代。所有空位(gap)作為缺失處理,每個(gè)特征值作為等權(quán)處理。系統(tǒng)發(fā)育樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的可靠性用1 000次重復(fù)抽樣(replicates)的自展分析(bootstrap,BS)來(lái)檢驗(yàn)。

利用Median-joining(MJ)算法對(duì)trnL-F序列進(jìn)行網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)分析[34],使用Network 4.1.1.2軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 trnL-F序列分析

trnL-F序列的核苷酸多態(tài)性估計(jì)包括位點(diǎn)總數(shù)(n)、分離位點(diǎn)數(shù)(s)、比對(duì)多態(tài)性平均數(shù)(π)、分離位點(diǎn)多態(tài)性平均數(shù)(θ w)、以及序列中性突變檢測(cè),結(jié)果列于表2。trnL-F序列的堿基轉(zhuǎn)換(si)為4,顛換(sv)為5;trnL-F序列的堿基頻率A=0.326、T=0.365、C=0.167、G=0.142,轉(zhuǎn)換與顛換偏向比R=0.609;用最大似然法估計(jì)的堿基替代率如表3所示,其中顛換率明顯高于轉(zhuǎn)換率。

表2 trnL-F序列的核苷酸多態(tài)性估計(jì)以及序列中性突變檢測(cè)Table 2 Estimates of nucleotide diversity and test statistics for trnL-F sequences

表3 最大似然法估計(jì)的堿基替代率Table 3 Base substitution based on maximum likelihood

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析及網(wǎng)狀進(jìn)化分析

34份廣義披堿草屬材料、14份相關(guān)二倍體材料和外類群的trnL-F序列排序后,位點(diǎn)總數(shù)為772個(gè),其中變異位點(diǎn)145個(gè)(占位點(diǎn)總數(shù)的18.78%),信息位點(diǎn)58個(gè)(占位點(diǎn)總數(shù)的7.51%),保守位點(diǎn)627個(gè)(占位點(diǎn)總數(shù)的81.22%)。

最大簡(jiǎn)約分析得到 310棵簡(jiǎn)約樹,樹長(zhǎng)(tree length)為202,一致性指數(shù)CI(consistency indenx)為0.792 1,保持性指數(shù)RI(retention index)為0.800 9,50%多數(shù)一致樹如圖1所示。簡(jiǎn)約分析將所有材料分為三大支(St支、Ns+H支和P+W支)。St支包括了除黑藥仲彬草、梭羅仲彬草、H.duthiei、長(zhǎng)芒猬草外所有的廣義披堿草屬物種和擬鵝觀草屬二倍體物種,自展支持率(BS)為50%。Ns+H支(BS為70%)是由Ns亞支(BS為96%)和H亞支(95%)組成的。Ns亞支包括2個(gè)新麥草屬物種脆軸新麥草、新麥草和2個(gè)猬草屬物種H.duthiei和長(zhǎng)芒猬草;H亞支由大麥屬二倍體物種布頓大麥、北野大麥和芒穎大麥組成。P+W支包括了P亞支(BS為94%)和W亞支(BS為64%)。二倍體冰草屬物種與黑藥仲彬草和梭羅仲彬草組成了P亞支,而2個(gè)南麥屬植物組成W亞支。

為顯示所有含St染色體組的廣義披堿草屬物種中St染色體組的來(lái)源,根據(jù)trnL-F序列構(gòu)建了網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)圖(圖2)。48個(gè)類群形成47個(gè)單倍型(haplotype),結(jié)果顯示了高水平的單倍型多態(tài)性。trnL-F序列將廣義披堿草屬植物分為三大支,與根據(jù)最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建的系統(tǒng)樹一致。在St支中,所有物種被劃分為2個(gè)類群。分布于亞洲的擬鵝觀草屬二倍體物種(黎巴嫩擬鵝觀草、烏克蘭擬鵝觀草、細(xì)長(zhǎng)擬鵝觀草和糙緣擬鵝觀草)與廣布亞洲的鵝觀草屬、披堿草屬、仲彬草屬和猬草屬物種聚為一類,為亞洲類群。其中,大叢鵝觀草距P+W支最近,它們之間發(fā)生了14個(gè)位點(diǎn)的突變。分布于北美的穗狀擬鵝觀草與大松鼠尾巴草、加拿大裂穎草、哇瓦披堿草、喜馬拉雅鵝觀草、加拿大披堿草、鵝觀草和北方冰草組成北美類群。

圖1 基于廣義披堿草屬及其相關(guān)屬trnL-F序列的MP 50%多數(shù)一致樹Fig.1 50%majority-rule MP tree inferred from the trnL-F data of Elymus sensu lato and its closely related species分支上數(shù)字為自展值(>50%)Numbers above the branches indicate bootstrap values>50%

圖2 基于廣義披堿草屬及其相關(guān)屬trnL-F序列的MJ網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)圖Fig.2 MJ network of the Elymus sensu lato and its closely related species

3 討論

3.1 廣義披堿草屬及其近緣屬的系統(tǒng)親緣關(guān)系

Hsiao等[35]采用ITS序列構(gòu)建了小麥族30個(gè)二倍體物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,揭示出小麥族的染色體組都是單系的,P和W染色體組的關(guān)系最近,H染色體組處于小麥族系統(tǒng)發(fā)育的基部。細(xì)胞學(xué)資料表明:St和Y染色體組有較近的親緣關(guān)系,St、P和W染色體組的關(guān)系也很近,它們與H和Ns染色體組的關(guān)系較遠(yuǎn)[36]。trnL-F片段是單拷貝序列,其基因間隔區(qū)片段具有較多的插入缺失和較高比例的置換突變,且易于擴(kuò)增,因此,該片段已被成功應(yīng)用于解決種間或種上等高級(jí)分類等級(jí)的系統(tǒng)學(xué)研究[24,25]。本研究結(jié)果表明,trnL-F基因樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)按照染色體組St、P、W、H和Ns分成5個(gè)單系,含P染色體組的所有二倍體種聚成一支和含W染色體組物種的分支構(gòu)成姊妹群;含H染色體組的所有二倍體種聚成一支和含Ns染色體組物種的分支構(gòu)成姊妹群?？梢钥闯?P與W染色體組間關(guān)系很近,H和Ns染色體組間關(guān)系較近而與P、W和St關(guān)系較遠(yuǎn)。此結(jié)果基本上與過(guò)去的分子生物學(xué)和細(xì)胞學(xué)的證據(jù)得到的結(jié)果相同。

在披堿草屬、鵝觀草屬、猬草屬、裂穎草屬和仲彬草屬中,有些物種具有不同的染色體組組成但卻歸入同一屬內(nèi),如:披堿草屬內(nèi)存在StYH、StH、StYW等幾種染色體組組成;而具有相同染色體組的物種被劃為不同的屬,如:鵝觀草和垂穗披堿草同具StYH染色體組但卻被分別劃入鵝觀草屬和披堿草屬中。這是由于過(guò)去單純按照形態(tài)學(xué)特征來(lái)進(jìn)行的劃分,缺乏許多物種的細(xì)胞學(xué)資料造成的。隨著大量物種的細(xì)胞學(xué)資料和分子生物學(xué)資料的積累,這些屬的系統(tǒng)地位和物種的關(guān)系將逐步澄清。Jakob和Blattner[37]基于葉綠體trnL-F序列,發(fā)現(xiàn)利用建樹的系統(tǒng)分析方法研究大麥屬植物系統(tǒng)親緣關(guān)系普遍存在零支長(zhǎng)分支、節(jié)點(diǎn)支持率較低,對(duì)于大麥屬物種間系統(tǒng)關(guān)系處理較困難。本研究中,披堿草屬、鵝觀草屬、猬草屬、裂穎草屬和仲彬草屬中大部分物種都聚類在St支中,但是仍然出現(xiàn)支節(jié)點(diǎn)支持率很低和較多的零支長(zhǎng)分支問題,沒有找到這5個(gè)屬相應(yīng)的單獨(dú)分支。因此,對(duì)5個(gè)屬的系統(tǒng)地位和屬間系統(tǒng)關(guān)系的處理比較困難。但是,對(duì)于仲彬草屬和猬草屬中一些物種的系統(tǒng)學(xué)關(guān)系,可以提供證據(jù)。仲彬草屬的黑藥仲彬草和梭羅仲彬草與冰草屬的二倍體物種聚類在一起,表明黑藥仲彬草和梭羅仲彬草與冰草屬的關(guān)系較近。猬草屬的模式種猬草聚在St支中,而H.duthiei和長(zhǎng)芒猬草聚在Ns支中,表明它們具有不同的染色體組成。該結(jié)果支持利用細(xì)胞學(xué)的研究結(jié)果[14,15],將猬草歸入披堿草屬中,而將H.duthiei和長(zhǎng)芒猬草歸入賴草屬中。

3.2 廣義披堿草屬物種的母本染色體來(lái)源

在禾草植物當(dāng)中,葉綠體基因組為母性遺傳,通常被用于推斷雜交物種形成中的母本來(lái)源。許多研究者通過(guò)葉綠體基因組的DNA片段如:ndhF、trnL-F、rpoA等基因片段,對(duì)小麥族多年生物種的母本來(lái)源進(jìn)行研究,結(jié)果表明,具有St染色體組的物種在形成雜種時(shí)更容易做母本[23-25]。但是,根據(jù)細(xì)胞學(xué)的研究結(jié)果,具StYP染色體組成的仲彬草屬物種的母本來(lái)源于P染色體組而非St染色體組[26]。本研究中,由trnL-F序列構(gòu)成的系統(tǒng)進(jìn)化樹和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)圖可看出:大部分具St染色體組的物種與擬鵝觀草屬二倍體物種聚類在一起,表明他們的母本染色體組供體為St染色體組。但是,仲彬草屬的黑藥仲彬草和梭羅仲彬草與二倍體冰草屬物種聚為一支,且支持率很高,可以推斷在仲彬草屬中有些物種如黑藥仲彬草和梭羅仲彬草的母本來(lái)源于冰草屬物種,而一些物種的母本則來(lái)源于擬鵝觀草屬物種。形態(tài)上,仲彬草屬植物是介于冰草和鵝觀草之間,黑藥仲彬草和梭羅仲彬草小穗排列緊密更像冰草,而戈壁灘仲彬草和硬桿仲彬草小穗稀疏更像鵝觀草[26]。從此結(jié)果看出,似乎母本染色體組來(lái)源與仲彬草屬物種的形態(tài)特征有聯(lián)系,但是還需利用更多的材料,采用細(xì)胞學(xué)和分子手段等相結(jié)合的方法,來(lái)進(jìn)行更深入系統(tǒng)的研究。

細(xì)胞學(xué)研究表明,猬草屬模式種猬草具StH染色體組,因此被 L?ve[2]和Dewey[3]放在披堿草屬,然而 H.duthiei、長(zhǎng)芒猬草具NsXm染色體組與賴草屬物種的染色體組相同[14,15]。本研究中,猬草與二倍體擬鵝觀草屬物種聚類在一起,表明其母本染色體組供體為St染色體組,而其他2個(gè)猬草屬物種H.duthiei,長(zhǎng)芒猬草聚類在Ns支中,表明它們母本來(lái)源于新麥草屬物種。因此,猬草屬的模式種與其他物種的母本來(lái)源不同,此結(jié)果也支持目前依據(jù)細(xì)胞學(xué)資料對(duì)猬草屬物種的分類處理[14,15]。

3.3 擬鵝觀草屬二倍體物種St染色體組的分化

細(xì)胞學(xué)證據(jù)表明了St染色體組在不同的二倍體物種中具有一定程度的分化[21,38]。Sun等[39]根據(jù)RPB2基因序列的數(shù)據(jù),提出二倍體擬鵝觀草屬物種黎巴嫩擬鵝觀草的RPB2基因序列不同于糙緣擬鵝觀草和穗狀擬鵝觀草。Yu等[40]根據(jù)ITS序列的分析結(jié)果,表明二倍體擬鵝觀草屬物種聚在不同的分支中,認(rèn)為它們之間有分化。

網(wǎng)狀分析可以將單個(gè)突變分離成比鄰的單倍型,因此能反映突變速率較低的葉綠體基因單倍型間的基因譜系關(guān)系(genealogical relationships),即能夠區(qū)分序列間的單個(gè)堿基突變、揭示物種的來(lái)源、多倍體物種的供體[36,41,42]。本研究選用的5個(gè)擬鵝觀草屬二倍體物種具有不同的地理分布:黎巴嫩擬鵝觀草主要分布于伊朗地中海一帶;細(xì)長(zhǎng)擬鵝觀草分布于西亞高加索;糙緣擬鵝觀草分布于中亞、克里米亞和高加索;烏克蘭擬鵝觀草主要分布于東亞地區(qū);穗狀擬鵝觀草則分布于北美西部直到阿拉斯加。trnL-F基因序列的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)分析表明,5個(gè)地理分布不同的擬鵝觀草屬二倍體物種沒有形成一個(gè)單系組,且他們之間具有較多的突變位點(diǎn),表明這幾個(gè)二倍體物種間存在一定程度的分化。

Hsiao等[35]認(rèn)為:黎巴嫩擬鵝觀草分布于地中海沿岸地區(qū),是較為古老的擬鵝觀草屬物種,而穗狀擬鵝觀草主要分布于北美,是最近引入到美國(guó)的。從地理分布來(lái)看,雖然穗狀擬鵝觀草的分布相隔其他擬鵝觀草屬物種遠(yuǎn),但是它與黎巴嫩擬鵝觀草之間的突變位點(diǎn)數(shù)為12,而黎巴嫩擬鵝觀草與烏克蘭擬鵝觀草之間的突變位點(diǎn)數(shù)大于20,表明黎巴嫩擬鵝觀草與穗狀擬鵝觀草之間的關(guān)系較近,而與烏克蘭擬鵝觀草的關(guān)系要遠(yuǎn)些,該結(jié)果也與Liu等[24]利用ITS序列構(gòu)建二倍體物種的系統(tǒng)樹結(jié)果是一致的。因此,穗狀擬鵝觀草可能是由亞洲分布的物種擴(kuò)散遷移至美洲,由于地理隔離而獨(dú)立成種。

3.4 St染色體組在廣義披堿草屬物種中的分化

雜交-分化是植物演化的重要過(guò)程,也是物種形成的主要?jiǎng)恿χ籟43]。葉綠體基因由于是單親遺傳,可以在相同的母本背景下探討物種之間的母本染色體組的變異。本研究中,除少數(shù)仲彬草屬物種外,其余廣義披堿草屬物種的母本染色體組均為St染色體組。因此,可以比較在多倍體物種中St染色體組的異同。在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)圖的St支當(dāng)中,大部分分布于亞洲的物種聚類在一起構(gòu)成了亞洲類群,而分布于北美的物種聚類在北美類群中,表明這2個(gè)類群物種的St染色體組有變異。亞洲類群中大叢鵝觀草與冰草之間僅有14個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變,表明其St染色體組發(fā)生了分化,這個(gè)分化的St染色體組與冰草中的P染色體組關(guān)系較近。直立披堿草和短柄鵝觀草在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)圖中遠(yuǎn)離了其他廣義披堿草屬植物。直立披堿草含有StYW染色體組,僅分布于澳大利亞和新西蘭等地,因此,其St染色體組在參與異源多倍體物種形成的過(guò)程中,可能受到澳洲獨(dú)特的地理環(huán)境影響造成了St染色體組在這一地區(qū)的嚴(yán)重分化。該結(jié)果也支持顏濟(jì)等[26]將具有StYW染色體組組成的大洋洲特產(chǎn)的物種處理到花鱗草屬(Anthosachne)中。

3.5 廣義披堿草屬物種起源的推斷

St染色體組在廣義披堿草屬中是最重要的基本染色體組。目前,關(guān)于廣義披堿草屬物種中St染色體組具體的擬鵝觀草屬供體種的報(bào)道還很少。過(guò)去的觀點(diǎn)認(rèn)為北美與亞洲的廣義披堿草屬物種是獨(dú)立起源的[18,19]。但是目前分子證據(jù)表明黎巴嫩擬鵝觀草可能沒有參與披堿草屬物種的形成[20]。在亞洲,尤其是中亞山區(qū),被認(rèn)為是廣義披堿草屬植物的起源和遺傳多樣性中心,這是因?yàn)檫@個(gè)地區(qū)擁有最豐富的廣義披堿草屬物種,且這些多倍體物種具備不同倍性(2n=4x=28、2n=6x=42、2n=8x=56)和不同的染色體組組成[3]。本研究中,大部分分布于亞洲的廣義披堿草屬物種與其相同分布的擬鵝觀草屬二倍體物種(黎巴嫩擬鵝觀草、烏克蘭擬鵝觀草、細(xì)長(zhǎng)擬鵝觀草和糙緣擬鵝觀草)聚在亞洲類群中,暗示這4個(gè)擬鵝觀草屬物種可能參與了大部分廣義披堿草屬植物的起源。其中黎巴嫩擬鵝觀草、阿拉善鵝觀草、纖毛鵝觀草和直穗鵝觀草處在2個(gè)單倍型(RELYT和HYPAT)構(gòu)成的節(jié)點(diǎn)端部,暗示黎巴嫩擬鵝觀草可能參與了這些物種的起源。分布于北美的物種大松鼠尾巴草、加拿大裂穎草、北方冰草、哇瓦披堿草和加拿大披堿草與穗狀擬鵝觀草聚在一起,推斷穗狀擬鵝觀草可能參與了這些北美物種的起源。分布于北美的猬草與亞洲物種聚在一起,表明猬草的原始祖先種可能分布于亞洲,之后再擴(kuò)散遷移到美洲的,此結(jié)果也驗(yàn)證了亞洲是廣義披堿草屬植物的起源和遺傳多樣性中心的假說(shuō)。

由不同物種相互雜交后再進(jìn)行多倍化過(guò)程,導(dǎo)致物種的形成是多倍體物種形成的主要方式[43]。物種的多倍化過(guò)程是動(dòng)態(tài)的,可以不斷的與親本雜交,也可以與相同或更高倍性的物種雜交,因此,許多多倍體物種經(jīng)歷了多次雜交事件而起源[44]。垂穗披堿草、喜馬拉雅鵝觀草和鵝觀草的染色體組組成均為StYH,且都分布于亞洲,但是在形態(tài)上卻具有差別:垂穗披堿草具每穗軸節(jié)著生2個(gè)小穗且排列緊密,具有披堿草屬物種的特征,而喜馬拉雅鵝觀草和鵝觀草為每穗軸節(jié)著生1個(gè)小穗,排列疏松更像鵝觀草屬植物[2,3]。本研究的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)分析表明,垂穗披堿草、喜馬拉雅鵝觀草和鵝觀草的St染色體組供體差異較大。垂穗披堿草的St染色體組與亞洲的擬鵝觀草屬二倍體物種較近,而喜馬拉雅鵝觀草和鵝觀草的St染色體組更接近于北美的擬鵝觀草屬二倍體物種。根據(jù)此結(jié)果推測(cè),具StYH染色體組組成的多倍體物種可能經(jīng)歷了多次重復(fù)雜交過(guò)程,因而導(dǎo)致了其母本St染色體組的差異,這種多次重復(fù)雜交的多重起源方式,在其他物種中也有發(fā)現(xiàn)[24,43,44]。

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