周 舟，曾建國(guó)，彭 淼，鐘曉紅,*，李良導(dǎo)，劉 婷

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

柿果多酚提取工藝優(yōu)化

周 舟1，曾建國(guó)1，彭 淼2，鐘曉紅1,*，李良導(dǎo)2，劉 婷1

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間和提取溫度4個(gè)因素對(duì)柿果總酚及縮合多酚超聲提取效果的影響，并采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明影響因素對(duì)提取效率影響順序?yàn)椋阂掖俭w積分?jǐn)?shù)＞料液比＞提取時(shí)間＞提取溫度。最佳提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)90%、料液比1∶40(g/mL)、時(shí)間30min、提取溫度40℃，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，總酚提取率為2.061%。

柿；果實(shí)多酚；縮合多酚；提取

柿(Diospyros kaki L.)，為柿樹(shù)科柿屬植物，世界上柿科植物有Diospyros L.、Euclea L.、Lissocarpa Bentn.3個(gè)屬共500余種[1]。柿原產(chǎn)于我國(guó)長(zhǎng)江流域，我國(guó)也是世界上最大的柿樹(shù)種植國(guó)。果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨(dú)特，具有很高的食用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值及醫(yī)療保健效果，歷來(lái)深受人們的喜愛(ài)[2-3]。我國(guó)柿品種繁多，一般根據(jù)柿果澀味的差別，將柿品種分為完全澀柿(pollination contentas astring，PCA)，不完全澀柿(pollination variant astringent，PVA)，不完全甜柿(pollination variant nonastringent，PVNA)和完全甜柿(pollination content nonastringent，PCNA)，其中澀柿類(lèi)品種柿果采收后有澀味，需人工脫澀后方可食用，我國(guó)所產(chǎn)的品種多屬澀柿類(lèi)[4]。研究表明，柿果中含有大量的多酚類(lèi)物質(zhì)，且柿果中的多酚主要為縮合多酚，具有抑制人淋巴細(xì)胞白血病、降血壓、抗氧化性、清除自由基以及抑制蛇毒等多種功能[5-9]。目前，對(duì)柿的研究主要集中在柿樹(shù)栽培、柿果脫澀及貯藏等方面，對(duì)于柿果多酚的提取和綜合利用的研究還比較少。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)柿果多酚超聲輔助提取進(jìn)行優(yōu)化，以期為柿果多酚的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

供試品種為長(zhǎng)沙牛心柿，2010年7月采自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)果園，于柿樹(shù)朝陰、陽(yáng)面，樹(shù)冠內(nèi)外以及樹(shù)干高低處采集發(fā)育正常的柿果；福林酚試劑、原花青素標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；沒(méi)食子酸、香草醛、無(wú)水碳酸鈉、乙醇、丙酮、甲醇、鹽酸。

U-3310紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；組織搗碎勻漿機(jī) 上海帥佳電子科技有限公司；超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取溶劑的選擇

對(duì)乙醇、甲醇和丙酮3種溶劑提取時(shí)柿果中總酚和縮合多酚的提取效果進(jìn)行考察，以確定合適的提取溶劑。采用50%、60%、70%、80%、90%體積分?jǐn)?shù)對(duì)3種溶劑進(jìn)行對(duì)比分析。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

選取料液比(柿果鮮質(zhì)量與不同乙醇體積分?jǐn)?shù)之比，g/mL)、提取時(shí)間和提取溫度3個(gè)可能影響提取效果的因素，以總酚和縮合多酚含量為檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以確定相關(guān)因素及各因素的適宜范圍。各因素水平如下：料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30；超聲時(shí)間10、20、30、40min；超聲溫度30、40、50、60℃。

1.2.3 柿果多酚提取正交試驗(yàn)

根據(jù)溶劑選擇實(shí)驗(yàn)以及單因素試驗(yàn)確定的范圍，選定乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間和提取溫度4個(gè)主要影響因素進(jìn)行正交試驗(yàn)以確定最佳提取工藝條件，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and their coded levels in orthogonal array design

1.2.4 提取方法

將柿青果淋洗晾干，切塊，去皮后在搗碎機(jī)中搗碎后備用，準(zhǔn)確稱(chēng)取2.5g，按照單因素和正交試驗(yàn)中設(shè)置的不同提取條件分別進(jìn)行超聲輔助提取。收集各個(gè)提取條件下得到的提取液，抽濾得濾液，減壓濃縮，濃縮液用提取溶劑定容至100mL備用，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.5 總酚(total polyphenols，TP)含量的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[10]中的測(cè)定方法，繪制沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得吸光度(A)與沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(C，mg/mL)之間的回歸方程為A=72.371C＋0.0364，R2=0.9988。精密量取不同處理?xiàng)l件下制得的樣品液0.1mL于10mL容量瓶中，定容，測(cè)定其吸光度，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出柿果多酚質(zhì)量濃度(C，mg/mL)，之后計(jì)算出總酚含量。

1.2.6 縮合多酚(condensed polyphenols，CP)含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[11]中的測(cè)定方法，繪制原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線，得吸光度(A)與原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(C，mg/mL)之間的回歸方程為A=8.2600C-0.0268，R2=0.9983。精密量取不同處理?xiàng)l件下制得的樣品液0.1mL于10mL容量瓶中，定容，測(cè)定其吸光度，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出柿果縮合多酚質(zhì)量濃度(C，mg/mL)，之后計(jì)算出縮合多酚含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

常用多酚類(lèi)物質(zhì)的提取劑有乙醇、甲醇及丙酮等，在柿成熟果果肉的提取中發(fā)現(xiàn)乙醇作為提取劑時(shí)溶出較多的雜質(zhì)常常使得過(guò)濾變得困難，不利于實(shí)驗(yàn)的后續(xù)處理，而甲醇、丙酮的過(guò)濾效果較好[12]。但是通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在柿青果果肉的提取中則過(guò)濾比較順利。柿果去皮后搗碎備用，同時(shí)稱(chēng)取2.5g，分別選用50%、60%、70%、80%、90%丙酮以及50%、60%、70%、80%、90%甲醇溶液和50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液，按料液比1∶40于40℃超聲提取30min，測(cè)定總酚以及縮合多酚的含量。

圖1 不同溶劑對(duì)總酚提取的影響Fig.1 Effects of different solvents on extraction rate of total polyphenols

從圖1、2可以看出，甲醇的提取效果較其他兩種試劑要好，但是差別不大。與此同時(shí)，由于本研究將被運(yùn)用到工藝生產(chǎn)中生產(chǎn)日化產(chǎn)品，考慮到安全因素，故選定乙醇作為提取溶劑。在以縮合多酚作為考察指標(biāo)時(shí)可以看出乙醇體積分?jǐn)?shù)越高提取效果越好，最終選定90%乙醇溶液作為提取溶劑。

圖2 不同溶劑對(duì)縮合多酚提取的影響Fig.2 Effects of different solvents on extraction rate of condensed polyphenols

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 料液比對(duì)提取效果的影響

稱(chēng)取2.5g搗碎后的柿果備用材料，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下(以90%乙醇作為提取溶劑、超聲溫度40℃、超聲時(shí)間30min)分別按1∶15、1∶20、1∶25、1∶30料液比超聲提取，過(guò)濾得提取液，定容后，測(cè)定提取液總酚及其縮合多酚含量(圖3)。結(jié)果表明：總酚和縮合多酚的提取量隨著料液比增大而逐漸增大，至1∶30時(shí)基本達(dá)到平衡，故料液比以1∶30為宜。

圖3 料液比對(duì)總酚和縮合多酚提取的影響Fig.3 Effect of material-to-liquid ratio on extraction rate of total polyphenols and condensed polyphenols

2.2.2 超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響

圖4 時(shí)間對(duì)總酚和縮合多酚提取的影響Fig.4 Effect of ultrasonic treatment time on extraction rate of total polyphenols and condensed polyphenols

料液比1∶30，其他條件同2.2.1節(jié)，分別按10、20、30、40min超聲時(shí)間超聲提取。過(guò)濾提取液，定容后，測(cè)定提取液總酚及其縮合多酚含量(圖4)。結(jié)果表明：總酚和縮合多酚的提取量隨著超聲時(shí)間的增加逐漸增加，在超聲30min時(shí)達(dá)到最大值，之后開(kāi)始下降。故超聲時(shí)間以30min為宜。

2.2.3 超聲溫度對(duì)提取效果的影響

超聲時(shí)間30min，其他條件同2.2.2節(jié)，分別在30、40、50、60℃超聲提取。過(guò)濾提取液，定容后，測(cè)定提取液總酚及其縮合多酚含量(圖5)。結(jié)果表明：總酚的提取量隨著超聲溫度的升高在40℃時(shí)達(dá)到最大值，之后逐漸下降?？s合多酚的提取量則是在50℃時(shí)達(dá)到最大值才下降。

圖5 時(shí)間對(duì)總酚和縮合多酚提取的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction rate of total polyphenols and condensed polyphenols

2.3 柿果多酚正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 柿果多酚提取工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design and corresponding experimental results %

表3 以縮合多酚為目標(biāo)產(chǎn)物的正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis for extraction rate of condensed polyphenols with various extraction conditions

根據(jù)表2極差分析可知：提取總酚的最佳條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1∶40、時(shí)間30min、提取溫度4 0℃；提取縮合多酚的最佳條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)90%、料液比1∶40、時(shí)間30min、提取溫度40℃。兩組數(shù)據(jù)中極差值最大為A(乙醇體積分?jǐn)?shù))，B(料液比)和C(提取時(shí)間)次之，D(提取溫度)最小。說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)是影響多酚提取效果的主要因素，料液比和提取時(shí)間也有一定的影響，而提取溫度影響較小。由表3、4方差分析可知，以總酚為檢測(cè)指標(biāo)時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比有顯著影響，提取時(shí)間和提取溫度沒(méi)有顯著影響；以縮合多酚為檢測(cè)指標(biāo)時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)有極顯著影響，料液比有顯著影響，提取時(shí)間和提取溫度無(wú)顯著影響。綜合單因素試驗(yàn)以及正交試驗(yàn)結(jié)果，以總酚為主要指標(biāo)分析其中縮合多酚含量，選定柿果多酚提取的最佳條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)90%、料液比1∶40、時(shí)間30min、提取溫度40℃。

表4 以總酚為目標(biāo)產(chǎn)物的正交試驗(yàn)方差分析Table 4 Variance analysis for results of orthogonal experiments of total polyphenol

3 結(jié) 論

通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)結(jié)果分析表明，本實(shí)驗(yàn)選擇的4個(gè)因素對(duì)多酚提取的影響差別較大，順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)＞料液比＞提取時(shí)間＞提取溫度。其中乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)柿果總酚和縮合多酚的提取影響較大，而溫度影響最小，而且通過(guò)單因素試驗(yàn)可以看出，溫度越高對(duì)提取效果越不利，這可能是由于多酚在高溫環(huán)境下不穩(wěn)定導(dǎo)致[13]，而且當(dāng)提取溫度比較高時(shí)，得到的提取液呈紅色，這應(yīng)該是由酚類(lèi)化合物的自縮合反應(yīng)所致[6,14]；柿果多酚中以沒(méi)食子酸為主[15]，而沒(méi)食子酸不溶于冷水。因此，最佳提取條件為90%乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比為1∶40、40℃超聲提取30min。

[1]傍島善次. 柿和人生[M]. 東京∶ 明玄書(shū)房, 1980∶ 1445.

[2]馬麗. 柿樹(shù)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用[J]. 林產(chǎn)化工通訊, 2004, 38(3)∶ 38-40.

[3]SHELA G, ZOFIA Z, MARIA F, et al. Comparative contents of dietary fiber, total phenolics, and Minerals in persimmons and apples[J]. Food Chemistry, 2001, 49(2)∶ 952-957.

[4]宗學(xué)普. 柿樹(shù)栽培技術(shù)[M]. 北京∶ 金盾出版社, 2000∶ 135-138.

[5]WU Paiwen, HWANG L S. Determination of soluble persimmon tannin by high performance gel permeation chromatography[J]. Food Research International, 2002, 35(8)∶ 793-800.

[6]GU Haifeng, LI Chunmei, XU Yujuan, et al. Structural features and antioxidant activity of tannin from persimmon pulp[J]. Food Research International, 2008, 41(2)∶ 208-217.

[7]AHN H S, JEONA T I, LEEA J Y, et al. Antioxidative activity of persimmon and grape seedextract∶ in vitro and in vivo[J]. Nutrition Research, 2002, 22(11)∶ 1265-1273.

[8]Del BUBBA M, GIORDANI E, PIPPUCCI L, et al. Changes in tannins, ascorbic acid and sugar content in astringent persimmons during on-tree growth and ripening and in response to different postharvest treatments [J]. Food Composition and Analysis, 2009, 22(7/8)∶ 668-677.

[9]DOWDLE J, ISHIKAWA T, GATZEK S, et al. Two genes in Arabidopsis thaliana encoding GDP-1-galactose phosphorylase are required for ascorbate biosynthesis and seedling viability[J]. The Plant Journal, 2007, 52 (4)∶ 673-689.

[10]徐金瑞, 張名位, 劉興華, 等. 黑大豆種質(zhì)抗氧化能力及其與總酚和花色昔含量的關(guān)系[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2006, 39(8)∶ 1545-1552.

[11]李春陽(yáng), 許時(shí)嬰, 王璋, 等. 香草醛-鹽酸法測(cè)定葡萄籽、梗中原花青素含量的研究[J]. 食品科學(xué), 2004, 25(2)∶ 157-162.

[12]顧海峰, 李春美, 鐘慧臻, 等. 柿子單寧優(yōu)化提取工藝探討[J]. 食品科技, 2007, 32(2)∶ 133-136.

[13]張東明. 酚酸化學(xué)[M]. 北京∶ 化學(xué)工業(yè)出版社, 2008∶ 107-108.

[14]石碧, 狄瑩. 植物多酚[M]. 北京∶ 科學(xué)出版社, 2000∶ 58.

[15]費(fèi)學(xué)謙, 周立紅, 龔榜初, 等. 不同甘、澀類(lèi)型柿果實(shí)單寧組成的差異及羅田甜柿單寧的特性[J]. 林業(yè)科學(xué)研究, 1999, 12(4)∶369-373.

Optimization of Extraction Process for Polyphenols from Persimmon Fruits

ZHOU Zhou1，ZENG Jian-guo1，PENG Miao2，ZHONG Xiao-hong1,*，LI Liang-dao2，LIU Ting1
(1. College of Horticulture and Gardening, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China；2. Orient Science and Technology College, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

Solvent extraction was used to extract polyphenols from persimmon fruits in this study. Among three organic solvent investigated, ethanol was found to be the most suitable solvent for extracting total polyphenols and condensed polyphenols from persimmon fruits. The following investigations were carried out to explore the effects of ethanol concentration, materialto-liquid ratio, extraction time and extraction temperature on total polyphenol yield and to optimize the four process conditions by one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods. Ethanol concentration was identified as the most important factor that affects total polyphenol yield followed by material-to-liquid ratio, extraction time and extraction temperature. The optimal extraction conditions for achieving both higher yields of total polyphenols and condensed polyphenols from persimmon fruits were ethanol concentration of 90%, material-to-liquid ratio of 1∶40, extraction time of 30 min and extraction temperature of 40 ℃. Under the optimal extraction conditions, the extraction rate of total polyphenols was up to 2.061%.

persimmon；total polyphenols；condensed polyphenols；extraction

TS201.1

A

1002-6630(2011)16-0117-04

2010-11-26

周舟(1984—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幱弥参锔咧祷?。E-mail：121372@163.com

*通信作者：鐘曉紅(1961—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)閳@藝和中藥資源開(kāi)發(fā)與利用。E-mail：xh-zhong@163.com