林 謙，楊勝遠，陸兆新，呂鳳霞，別小妹，鄒曉葵

嗜熱鏈球菌谷氨酸脫羧酶基因及其側(cè)翼區(qū)序列分析

林 謙1，楊勝遠2，陸兆新3,*，呂鳳霞3，別小妹3，鄒曉葵3

(1.玉林師范學(xué)院化學(xué)生物系，廣西 玉林 537000； 2.韓山師范學(xué)院生物系，廣東 潮州 521041；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

從嗜熱鏈球菌Streptococcus thermophilus Y-2的谷氨酸脫羧酶基因(gadB)及其兩側(cè)旁鄰序列出發(fā)，在GenBank中分別用Blastn、Blastx搜索同源序列。gadB在核酸水平上無法找到同源序列，在蛋白質(zhì)水平上與多種細菌的谷氨酸脫羧酶同源。根據(jù)谷氨酸脫羧酶的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株Y-2與具核梭桿菌Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum ATCC 10953的親緣關(guān)系最近。gadB的上游側(cè)翼區(qū)與嗜熱鏈球菌LMG 18311的插入序列IS1216轉(zhuǎn)座酶基因具有很高的相似性。gadB的下游側(cè)翼區(qū)在核酸水平上未找到同源序列，在蛋白質(zhì)水平上與谷氨酸/γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白有很高的相似性。菌株Y-2的gadB、gadC排列方式與大腸桿菌、弗氏志賀菌的相同，而與乳酸乳球菌、短小乳桿菌的相反。在已完成全基因組測序的3個模式株Streptococcus thermophilus LMG 18311、CNRZ1066、LMD-9中均含有插入序列 IS1216，但未發(fā)現(xiàn)谷氨酸脫羧酶基因gadB、谷氨酸/γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運蛋白基因gadC。

嗜熱鏈球菌；谷氨酸脫羧酶；γ-氨基丁酸；序列分析

谷氨酸脫羧酶(EC 4.1.1.15)在動物、植物、微生物中廣泛存在，催化谷氨酸的α-脫羧反應(yīng)，生成γ-氨基丁酸(GABA)，是生物體內(nèi)合成γ-氨基丁酸的關(guān)鍵酶。γ-氨基丁酸作為哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有降血壓、延緩神經(jīng)細胞衰老、治療精神疾病、抗焦慮等多種重要的生理功能，在醫(yī)藥、食品保健、化工、農(nóng)業(yè)等行業(yè)有廣泛的應(yīng)用[1]。

利用食品級微生物尤其是乳酸菌生產(chǎn)富含γ-氨基丁酸的保健食品具有獨特的優(yōu)勢，近年來受到國內(nèi)外的重視。目前已有多種乳酸菌的谷氨酸脫羧酶基因被克隆[2-4]，對谷氨酸脫羧酶基因的研究與改造是提高乳酸菌γ-氨基丁酸產(chǎn)量的有效手段。嗜熱鏈球菌是乳品發(fā)酵工業(yè)中重要的乳酸菌，全球每年消費的嗜熱鏈球菌乳制品市場價值約為400億美元，被人類食用的活菌數(shù)目估計達1021[5]。嗜熱鏈球菌雖然已有3個菌株完成了全基因組序列分析[5-6]，但谷氨酸脫羧酶基因(gadB)只在Y-2菌株中發(fā)現(xiàn)[7]，關(guān)于該基因的詳細分析尚沒有其他文獻資料。

本實驗擬對嗜熱鏈球菌Y-2菌株的谷氨酸脫羧酶基因及側(cè)翼區(qū)序列進行分析，以期為深入了解其γ-氨基丁酸的生物合成機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

嗜熱鏈球菌Y-2菌株為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院酶工程實驗室篩選并保藏的乳酸菌，有較高的谷氨酸脫羧酶活力[7-9]。

1.2 方法

嗜熱鏈球菌Y-2谷氨酸脫羧酶基因及側(cè)翼序列在前期工作中已被克隆并測序[10]，在GenBank中的登錄號為DQ871217，其中294～1673區(qū)域為谷氨酸脫羧酶基因gadB。

信號肽分析采用SignalP軟件 (http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)。啟動子預(yù)測工具為 http://www.fruitfly. org/seq_tools/promoter.html。

保守結(jié)構(gòu)域搜索采用NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫及在線分析工具http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan。

核酸對核酸的搜索程序用Blastn，核酸對蛋白質(zhì)的搜索程序用Blastx。系統(tǒng)發(fā)育樹分析采用ClustalX 1.83與MEGA 4軟件，算法選擇鄰近相連法(Neighborjoining)，Bootstrap重復(fù)次數(shù)設(shè)為1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 信號肽序列及啟動子分析

對谷氨酸脫羧酶用SignalP軟件分析，結(jié)果表明該酶不存在信號肽，與其他細菌的谷氨酸脫羧酶相同。gadB基因上游側(cè)翼序列預(yù)測結(jié)果如圖1所示。有兩段序列(214～259，231～276)的分值達0.99，超過了0.8，很可能是啟動子。至于是哪一個或者兩個序列都能驅(qū)動谷氨酸脫羧酶基因的表達，有待進一步研究。

圖1 啟動子預(yù)測結(jié)果Fig.1 Promoter prediction result

2.2 谷氨酸脫羧酶保守域

將Y-2菌株谷氨酸脫羧酶序列在NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫CDD中搜索，其29～379位氨基酸序列片段形成一個依賴于磷酸吡哆醛的脫羧酶保守結(jié)構(gòu)域(pfam00282)。在線網(wǎng)站工具http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan的分析結(jié)果表明26～362或26～377區(qū)域是依賴于磷酸吡哆醛的脫羧酶保守域，與CDD中搜索的結(jié)果一致。

2.3 谷氨酸脫羧酶系統(tǒng)發(fā)育分析

以菌株Y-2的谷氨酸脫羧酶基因序列在GenBank中搜索，程序為Blastn，E值為10，結(jié)果沒有搜索到任何相似序列。改用Blastp程序，以谷氨酸脫羧酶的氨基酸序列搜索，搜索到多個細菌的谷氨酸脫羧酶。與菌株Y-2的谷氨酸脫羧酶的氨基酸序列相似度最高的為梭形桿菌屬(84%)及雙歧桿菌屬的幾個菌株(82%～83%)，而與乳酸乳球菌IL1403、羅伊氏乳桿菌的相似度為68%；雖然肺炎鏈球菌與嗜熱鏈球菌同屬，然而二者的谷氨酸脫羧酶的氨基酸序列卻沒有同源關(guān)系，肺炎鏈球菌的谷氨酸脫羧酶與人類的相似度極高[11]。

根據(jù)多種細菌的谷氨酸脫羧酶序列，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖2可以看出，具核梭桿菌ATCC 10953與菌株Y-2位于同一個分支內(nèi)，與該分支最近的是雙歧桿菌屬。

2.4 gadB基因上游側(cè)翼序列分析

將gadB基因上游側(cè)翼序列在GenBank中搜索，程序選擇Blastn，在幾種乳酸菌中找到同源序列。相似度最高的是嗜熱鏈球菌S. thermophilus LMD-9、CNRZ1066、LMG18311，在乳酸乳球菌Lactococcus lactis subsp. cremoris SK11，腸球菌Enterococcus中也可找到同源序列。為了研究該段序列的可能表達產(chǎn)物，改用Blastx搜索，結(jié)果如圖3所示。gadB基因上游側(cè)翼序列的編碼產(chǎn)物與多種細菌的轉(zhuǎn)座酶具有同源性。相似度最高的是單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes str. 4b H7858)的一個蛋白，其次是嗜熱鏈球菌CNRZ1066、LMG18311的插入序列IS1216的轉(zhuǎn)座酶，與其他細菌的轉(zhuǎn)座酶也有較高的相似性。由此推斷，gadB基因上游很可能是一個轉(zhuǎn)座酶基因，這個轉(zhuǎn)座酶在多種細菌(Streptococcus thermophilus，Carnobacterium，Enterococcus faecalis)中比較保守。搜索，結(jié)果如圖4所示：具核梭桿菌Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum ATCC10953的谷氨酸/ γ-氨基丁酸逆向轉(zhuǎn)運蛋白與菌株Y-2 gadB基因下游側(cè)翼序列的編碼產(chǎn)物相似度最高，其次是幾種雙歧桿菌的功能未知蛋白以及其他細菌的谷氨酸/γ-氨基丁酸逆向轉(zhuǎn)運蛋白。由此可以推斷菌株Y-2的gadB基因下游是編碼谷氨酸/γ-氨基丁酸逆向轉(zhuǎn)運蛋白的基因。其他細菌的谷氨酸/γ-氨基丁酸逆向轉(zhuǎn)運蛋白的基因一般命名為gadC，本研究也依照這個慣例。

圖3 谷氨酸脫羧酶基因上游側(cè)翼序列的Blastx搜索結(jié)果Fig.3 Blastx result of glutamate decarboxylase gene upstream flanking sequence

2.6 gadB基因及其側(cè)翼區(qū)的組織結(jié)構(gòu)

根據(jù)序列分析的結(jié)果，推測gadB基因及其側(cè)翼區(qū)的組織結(jié)構(gòu)見圖5，谷氨酸脫羧酶基因gadB及側(cè)翼區(qū)的核苷酸序列見圖6。

圖5 gadB基因及其側(cè)翼序列的組織結(jié)構(gòu)Fig.5 Putative organization of gadB gene and flanking sequences

2.5 gadB基因下游側(cè)翼序列分析

圖4 谷氨酸脫羧酶基因下游側(cè)翼序列的Blastx搜索結(jié)果Fig.4 Blastx result of glutamate decarboxylase gene downstream flanking sequence

將gadB基因下游側(cè)翼序列在NCBI中用Blastn搜索，E值設(shè)為10，未發(fā)現(xiàn)任何同源序列。改用Blastx

圖6 gadB基因及其側(cè)翼區(qū)的核苷酸序列Fig.6 Nucleotide sequcence of glutamate decarboxylase gene and flanking regions

3 討 論

嗜熱鏈球菌Y-2的谷氨酸脫羧酶基因gadB與谷氨酸/ γ-氨基丁酸逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因gadC在染色體上緊密相鄰，兩者距離只有二十幾個核苷酸，在gadB上游十幾核苷酸處發(fā)現(xiàn)有高度疑似啟動子的序列，而gadC前則沒有。這兩個基因很可能是屬于同一個操縱子，由同一個啟動子驅(qū)動表達。細菌處于酸性環(huán)境下必須保證細胞內(nèi)的pH值不能降得太低，谷氨酸脫羧酶、谷氨酸/ γ-氨基丁酸逆向轉(zhuǎn)運蛋白一般與細菌的耐酸機制有關(guān)。細菌從細胞外把谷氨酸運到細胞內(nèi)，由谷氨酸脫羧酶將其脫羧生成GABA，再由逆向轉(zhuǎn)運蛋白將GABA運到細胞外。在一次脫羧反應(yīng)中，酸性的氨基酸(谷氨酸)轉(zhuǎn)變成了中性的氨基酸(GABA)，消耗了一個H+，這樣就有利于維持細胞內(nèi)pH值的穩(wěn)定。雖然嗜熱鏈球菌是來源于酸奶的益生菌，但它的gadBC排列方式與病原菌大腸桿菌、弗氏志賀菌的相同[12-13]，而與乳酸乳球菌、短小乳桿菌的排列方式gadCB相反[14-15]。值得注意的是，在用Blastp搜索嗜熱鏈球菌谷氨酸脫羧酶的同源蛋白質(zhì)時，發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌Bifidobacterium angulatum DSM20098、Bifidobacterium dentium ATCC27678分別有一個未知蛋白(ZP_04447568、ZP_02918104)，從序列同源性推斷它們應(yīng)該為谷氨酸脫羧酶GadB，從系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)來看，這兩個推斷的谷氨酸脫羧酶與嗜熱鏈球菌的谷氨酸脫羧酶關(guān)系頗為接近。而且，類似于嗜熱鏈球菌，這兩個雙歧桿菌谷氨酸脫羧酶的編碼基因gadB下游也緊跟著編碼氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白(ZP_04447567、ZP_02918103)的基因，從這兩個蛋白質(zhì)的序列同源性分析推斷，它們應(yīng)該是谷氨酸/γ-氨基丁酸逆向轉(zhuǎn)運蛋白GadC。由此可見，在乳酸菌中，既有與嗜熱鏈球菌的gadBC排列方式相同的雙歧桿菌，也有排列方式相反的乳酸乳球菌、短小乳桿菌，gadB、gadC兩個基因的排列順序并無一定規(guī)律，但無論順序如何，這兩個基因在基因組中一般都緊密相連，以達到協(xié)調(diào)表達、維持細胞內(nèi)pH值穩(wěn)定的目的。

菌株Y-2谷氨酸脫羧酶基因gadB前的序列很可能是一個轉(zhuǎn)座酶基因，這個基因在其他細菌(不局限于乳酸菌)的基因組中也可找到，是插入序列IS1216的轉(zhuǎn)座酶。嗜熱鏈球菌已有3個菌株(LMG18311, CNRZ1066，LMD-9)完成了全基因組序列分析[5-6]，它們均含有IS1216轉(zhuǎn)座因子，但并未發(fā)現(xiàn)谷氨酸脫羧酶基因g a d B與谷氨酸/ GABA逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因gadC，可能gadBC在菌株Y-2中的出現(xiàn)與轉(zhuǎn)座有關(guān)。雖然嗜熱鏈球菌與肺炎鏈球菌同屬，但它們的谷氨酸脫羧酶并沒有同源關(guān)系。菌株Y-2的谷氨酸脫羧酶與具核梭桿菌、雙歧桿菌的高度相似，而它們均是定居于人體口腔、腸道內(nèi)的正常菌群，因此菌株Y-2的谷氨酸脫羧酶的起源是一個值得研究的問題。

目前國內(nèi)外對乳酸菌的谷氨酸脫羧酶的研究是一個熱點，已有多種乳酸菌的谷氨酸脫羧酶基因被克隆并表達，但對嗜熱鏈球菌谷氨酸脫羧酶的分子生物學(xué)研究還是空白。研究嗜熱鏈球菌谷氨酸脫羧酶的基因?qū)α私馐葻徭溓蚓?氨基丁酸的生物合成及工業(yè)化生產(chǎn)有重要的作用。

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Sequence Analysis of Glutamate Gecarboxylase Gene and Flanking Regions from Streptococcus thermophilus Y-2

LIN Qian1，YANG Sheng-yuan2，LU Zhao-xin3,*，LFeng-xia3，BIE Xiao-mei3，ZOU Xiao-kui3
(1. Department of Chemistry and Biology, Yulin Normal University, Yulin 537000, China；2. Department of Biology, Hanshan Normal University, Chaozhou 521041, China；3. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The glutamate decarboxylase gene (gadB) and its flanking regions from Streptococcus thermophilus Y-2 were investigated by homologous search in GenBank with Blastn and Blastx. There was no any other gene showing significant similarity with gadB, while the protein product of gadB had high similarity with several bacterial glutamate decarboxylases. Phylogenetic tree based on glutmamte decarboxylase sequences indicated that Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum ATCC 10593 showed the closest relationship with S. thermophilus Y-2. The upstream flanking region of gadB was homologous to bacterial transposases, while the downstream flanking region of gadB encoding a putative protein was similar to bacterial glutamate/γ-aminobutyric acid antiporters (GadC). The order of gadB and gadC in S. thermophilus Y-2 genome was similar to that of E. coli and Shigella flexneri, but different from that of Lactococcus lactis and Lactobacillus brevis. Insertion sequence IS1216 was present in genomes of S. thermophilus LMG 18311, CNRZ1066, and LMD-9, but not gadB or gadC.

Streptococcus thermophilus；glutamate decarboxylase；γ-aminobutyric acid；sequence analysis

Q78

A

1002-6630(2011)03-0121-05

2010-06-02

廣東省自然科學(xué)基金項目(8452104101001546)；國家星火計劃項目(2008GA780032)；

玉林師范學(xué)院高層次人才科研啟動基金項目(G2009042)

林謙(1977—)，男，博士，研究方向為工業(yè)微生物技術(shù)。E-mail：linqian1977@163.com

*通信作者：陸兆新(1965—)，男，教授，博士，研究方向為食品微生物及生物技術(shù)。E-mail：fmb@njau.edu.cn