徐艷華,陳曉云綜述,汪維偉審校

（重慶醫(yī)科大學(xué)干細(xì)胞與組織工程實(shí)驗(yàn)室組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 400016）

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease,IBD）包括潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis,UC）和克羅恩病（Crohn′s disease，CD）,有終生復(fù)發(fā)傾向,重癥患者遷延不愈,預(yù)后不良。此病歐美發(fā)達(dá)地區(qū)發(fā)病率高,而亞洲國家隨著生活水平的提高,其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢。IBD的病因和發(fā)病機(jī)制未完全明確,目前的研究認(rèn)為由多因素相互作用所致,主要包括遺傳、免疫、環(huán)境等因素[1]。由于致病因素不盡相同,發(fā)病的具體環(huán)節(jié)不同,最終導(dǎo)致UC和CD組織損害的表現(xiàn)不同。CD病變可達(dá)上消化道,病因與特殊微生物關(guān)系密切,且家族傾向更明顯,使用抗生素有潛在預(yù)防和治療CD的作用,但對UC患者尚無樂觀的報道[2]。現(xiàn)有的IBD治療在于控制活動性炎癥和調(diào)節(jié)免疫紊亂,常用的有3類藥物：水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑。長期使用上述藥物又給患者帶來難以克服的不良反應(yīng),且對危重病例的療效有限,無法縮短IBD的自然病程。對病情危重者常須采用外科手術(shù)治療,外科手術(shù)治療后亦存在嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量以及術(shù)后復(fù)發(fā)等問題。

用干細(xì)胞移植治療IBD,最初多為血液系統(tǒng)惡性疾病合并炎癥性腸病時進(jìn)行干細(xì)胞移植的報道。Ditschkowski等[3]回顧了1994年7月至2002年8月施行的11例血液系統(tǒng)惡性疾病患者異基因外周血造血干細(xì)胞移植,這11例中7例合并CD,4例合并UC。移植后經(jīng)34個月隨訪,10例存活,均未表現(xiàn)IBD活動性,只有1例在移植后早期表現(xiàn)輕度持續(xù)性癥狀,提示異基因外周血造血干細(xì)胞移植有一定治療作用。2003年Burt等[4]首次以CD為指征進(jìn)行自體外周血造血干細(xì)胞移植，2例嚴(yán)重CD患者,腫瘤壞死因子-α等治療無效,克羅恩病活動指數(shù)（Crohn′s disease activity index,CDAI）評分大于250。干細(xì)胞通過環(huán)磷酰胺和粒細(xì)胞集落刺激因子動員,經(jīng)環(huán)磷酰胺和抗胸腺細(xì)胞球蛋白預(yù)處理后回輸。隨訪1年,患者病情緩解（CDAI評分小于100）。Garc í a-Olmo等[5]于2005年用自體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stern cells,MSCs）局部注射移植治療4例CD患者并發(fā)的9處瘺管,結(jié)果觀察到6處瘺管的外口在移植后8周末就被新生上皮覆蓋,其余2處瘺管外口存在不完全的閉合,內(nèi)容物外滲減少,在隨訪期間（12～30個月）未觀察到任何不良反應(yīng)。

1 MSCs的生物學(xué)特性

MSCs最早從骨髓中發(fā)現(xiàn),從臍血、胎盤、外周血、肌肉、血管、脂肪、皮膚等組織中也能培養(yǎng)出MSCs,并與骨髓MSCs有相同的多向分化潛能。大量研究證實(shí),在一定誘導(dǎo)條件下MSCs可以向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌腱細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞等中胚層細(xì)胞分化,M SCs還可以向外胚層的神經(jīng)元細(xì)胞和內(nèi)胚層的肝卵圓細(xì)胞分化。已有多項(xiàng)研究表明,把骨髓MSCs植入體內(nèi),可向造血以外的組織如骨、軟骨、肺、皮膚等處定位并分化為相應(yīng)的組織細(xì)胞。MSCs表面抗原表型兼有間充質(zhì)、內(nèi)皮和肌肉細(xì)胞的特征。其細(xì)胞表面標(biāo)記可分類為：特異性抗原,如SH2、SH3、SH4、STRO-1、α-平滑肌肌動蛋白（α-SM A）等；細(xì)胞因子及生長因子,如白細(xì)胞介素類、干細(xì)胞因子（SCF）、白細(xì)胞抑制因子（LIF）、單核細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）等；細(xì)胞因子及生長因子受體,如白細(xì)胞介素類受體、粒細(xì)胞集落刺激因子受體（G-CSFR）、血小板衍生生長因子受體（PDGFR）等；黏附分子,如整合素α ν β3、α ν β5、ICAM-1、ICAM-2、VCAM-1、內(nèi)皮素、CD44等；細(xì)胞外基質(zhì),如膠原Ⅰ～Ⅳ型、蛋白聚糖、纖維結(jié)合素、透明質(zhì)酸聚糖。目前MSCs表面標(biāo)記物研究結(jié)論極不一致,尚無一個理想的表面標(biāo)記物。

2 MSCs在移植受體腸道的遷移、定植

近年來通過對心、肝、腎、肺、皮膚等組織損傷的研究表明,自體骨髓MSCs有向上述損傷部位遷移并參與相應(yīng)組織修復(fù)的能力[6-7],其定向遷移可能與基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（SDF-1）、肝細(xì)胞生長因子（HGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶家族（MMPs）、Wnt信號通路等有關(guān)[8-11]。研究表明,MSCs移植入腸道損傷模型受體后能在損傷腸道發(fā)生定植。段進(jìn)糧等[12]將同種異體雄性大鼠的骨髓MSCs經(jīng)尾靜脈注射于雌性大鼠UC模型體內(nèi),移植后在不同的時間段取結(jié)腸組織做PCR分析。結(jié)果顯示,移植后第7天可在16.7%的大鼠的腸組織中檢測到供體的MSCs；移植后第2l天可在50.0%的大鼠的腸組織中檢測供體的MSCs,表明移植的MSCs可以定植于受體結(jié)腸。這與國外研究結(jié)果一致[13]。

3 MSCs促進(jìn)IBD腸道修復(fù)可能的機(jī)制

3.1 MSCs直接分化為腸黏膜上皮細(xì)胞 如前所述,MSCs具有多向分化潛能,在一定誘導(dǎo)條件下,可向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等方向分化。MSCs能否分化為腸黏膜上皮細(xì)胞,從而直接修復(fù)受損腸道？實(shí)驗(yàn)證明將DAPI標(biāo)記的第3代胎兒骨髓MSCs種植到腸結(jié)締組織塊表面培養(yǎng)12d時,免疫組化染色結(jié)果顯示在組織塊表面生長的標(biāo)記細(xì)胞有細(xì)胞角質(zhì)蛋白（cytokeratin,CK）及CK20的表達(dá)[14]。CK是上皮細(xì)胞的共同標(biāo)志之一,CK20則可表達(dá)于腸黏膜上皮細(xì)胞。這提示骨髓MSCs可以在腸壁結(jié)締組織上生長,并可分化為具有上皮細(xì)胞和具有腸上皮表型的細(xì)胞。體內(nèi)試驗(yàn)方面,韓欽等[15]研究發(fā)現(xiàn),在腸道放射性損傷模型中,經(jīng)尾靜脈移植的骨髓MSCs能快速歸巢到損傷的腸道局部,參與腸道上皮細(xì)胞的損傷修復(fù)。該實(shí)驗(yàn)組觀察到移植的骨髓MSCs多分布在腸黏膜上皮,且大部分分化為潘氏細(xì)胞,還有少量的杯狀細(xì)胞分化。移植后2個月,腸黏膜絨毛形態(tài)已基本恢復(fù)正常,提示移植的骨髓MSCs可分化為腸黏膜上皮功能細(xì)胞修復(fù)損傷部位。IBD腸道損傷與放射性腸道損傷不盡相同,故骨髓MSCs在體內(nèi)是否也能通過分化為腸黏膜上皮細(xì)胞修復(fù)IBD損傷腸道,需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

3.2 參與腸道免疫調(diào)節(jié) IBD的發(fā)病與遺傳、環(huán)境和免疫反應(yīng)異常,特別是腸道局部免疫缺陷有關(guān)。MSCs移植的免疫調(diào)節(jié)作用已在多種疾病的臨床和基礎(chǔ)研究中證實(shí)。目前MSCs移植也被成功應(yīng)用于循環(huán)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、骨關(guān)節(jié)等嚴(yán)重自身免疫相關(guān)疾病的治療中[16]。其機(jī)制可能為：一方面MSCs可分化為具有功能的細(xì)胞以修復(fù)受損組織,另一方面MSCs具有免疫調(diào)節(jié)作用。MSCs可逃避免疫反應(yīng),體外研究發(fā)現(xiàn),未分化的MSCs不能誘導(dǎo)異基因淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng),提示MSCs為天然且無免疫原性[17-18],當(dāng)分化為脂肪細(xì)胞,成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞后仍無免疫原性。即使在CD28刺激性抗體存在作用下，MSCs與人類白細(xì)胞抗原不相合淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)仍不能誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖[17]。MSCs不能激活T細(xì)胞,也不是CD8+細(xì)胞毒T細(xì)胞的靶目標(biāo)。動物實(shí)驗(yàn)也表明,異基因MSCs植入具有免疫活性機(jī)體后,能在體內(nèi)存活,且在局部微環(huán)境作用下能修復(fù)損傷組織[19]。MSCs有免疫調(diào)節(jié)作用：MSCs能抑制初始和記憶性T細(xì)胞,且無主要組織相溶性復(fù)合物限制性,無論MSCs來源于自體或“第三者”都有顯著抑制效應(yīng)。MSCs的免疫抑制作用可能由可溶性因子介導(dǎo),進(jìn)一步研究表明介導(dǎo)抑制效應(yīng)的可溶性因子可能是肝細(xì)胞生長因子（HGF）和轉(zhuǎn)化生長因子α（TGF-α）,當(dāng)加入抗HGF和抗TGF-α抗體后,與MSCs共培養(yǎng)T細(xì)胞增殖反應(yīng)可獲得恢復(fù)[20]。除作用于T細(xì)胞,MSCs還對樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等均有免疫調(diào)節(jié)作用[21]。故MSCs移植后定植在腸道,一方面可能分化成或促進(jìn)功能性腸道細(xì)胞的增生、修復(fù)。另一方面可能調(diào)節(jié)腸道異常免疫反應(yīng),發(fā)揮治療IBD的作用。但對此還有待更多、更深入的實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。

3.3 促進(jìn)損傷腸道微環(huán)境重建 正常情況下,腸道干細(xì)胞的不斷更新和增殖,促進(jìn)腸道上皮的不斷更新。在腸道受損傷后,腸道干細(xì)胞微環(huán)境受到破壞,干細(xì)胞不能進(jìn)行正常的增殖和分化。腸道干細(xì)胞微環(huán)境受Wnt、Notch、BMP等多條信號通路的共同調(diào)節(jié)[22]。腸上皮下肌成纖維細(xì)胞（intestinal subepithelial myofibroblasts,ISEMFs）位于小腸和大腸的基底膜附近,同時具有成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的表型,主要表達(dá)α-平滑肌肌動蛋白（α-SM A）,不表達(dá)結(jié)蛋白。據(jù)文獻(xiàn)報道[23],該類細(xì)胞通過直接分泌和旁分泌效應(yīng)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子,參與組成腸道干細(xì)胞微環(huán)境。這些細(xì)胞因子使之具有廣泛的生物學(xué)功能,如：參與調(diào)控腸道上皮細(xì)胞的增殖和分化、黏膜保護(hù)、傷口愈合、水和電解質(zhì)的運(yùn)輸、細(xì)胞外基質(zhì)的新陳代謝以及基膜的生長等過程。其中調(diào)控腸道上皮細(xì)胞的增殖和分化是通過對信號通路的調(diào)控而實(shí)現(xiàn)的。Brittan等[24]觀察到骨髓源性干細(xì)胞（bone marrow derived stem cells,BMDSCs）在輻射后腸道發(fā)生定植且可分化為ISEMFs,并且新形成的ISEMFs成簇分布于受體腸隱窩結(jié)構(gòu)附近。但是BMDSCs中含有多種干細(xì)胞組分,如造血干細(xì)胞、骨髓MSCs等,分化的ISEM Fs是否源于骨髓MSCs需進(jìn)一步深入探討。因此只能推斷MSCs可能分化為ISEMFs,通過改善受損的干細(xì)胞微環(huán)境來間接促進(jìn)腸上皮修復(fù)、損傷后小腸新生血管的形成,且可促進(jìn)血液動力學(xué)的恢復(fù),加快腸道干細(xì)胞微環(huán)境的重建。已有大量實(shí)驗(yàn)證明,骨髓MSCs在一定條件下可分化為血管內(nèi)皮樣細(xì)胞。Mayer等[25]推斷血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子可能通過自分泌和旁分泌的途徑誘導(dǎo)骨髓MSCs向血管內(nèi)皮樣細(xì)胞分化。Okuyama等[26]認(rèn)為組織局部微環(huán)境先促使骨髓MSCs表面的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體數(shù)量逐漸增加,骨髓MSCs在局部血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的刺激下轉(zhuǎn)化為血管內(nèi)皮樣細(xì)胞,從而完成組織的血管化進(jìn)程。

3.4 與腸道細(xì)胞發(fā)生融合促進(jìn)腸道修復(fù) “細(xì)胞融合”觀點(diǎn)認(rèn)為組織內(nèi)原位干細(xì)胞和（或）成熟細(xì)胞在受到嚴(yán)重破壞無法進(jìn)行重建時,通過細(xì)胞核轉(zhuǎn)移可以使成熟細(xì)胞重新進(jìn)入干細(xì)胞狀態(tài)[27]。Rizvi等[28]使用 Y-FISH和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白免疫組織化學(xué)法雙標(biāo)記腸上皮細(xì)胞,前者作為受體來源細(xì)胞標(biāo)記,后者作為供體來源標(biāo)記。在所檢測的細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn)了雙陽性的上皮細(xì)胞,證實(shí)了移植后供體骨髓來源細(xì)胞通過細(xì)胞融合機(jī)制參與了腸上皮細(xì)胞損傷的修復(fù)。如前所述,骨髓來源細(xì)胞成分復(fù)雜,除骨髓MSCs外還含有造血干細(xì)胞等。所以MSCs是否與成熟的腸上皮細(xì)胞或腸道干細(xì)胞發(fā)生了融合,尚需進(jìn)一步研究。

4 MSCs移植治療IBD的應(yīng)用前景

近些年來,MSCs引起了研究者的廣泛關(guān)注。大量基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)已證明MSCs對神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病、骨缺損疾病有明顯療效,對肝臟、肺、腎臟、皮膚等器官具有很好的組織修復(fù)作用。MSCs來源于骨髓,也存在于外周血液和其他組織中,易于獲取,體外培養(yǎng)條件不高、細(xì)胞分裂增殖快,且由它進(jìn)行自體移植時不存在組織配型和免疫排斥的問題,所以它在組織工程創(chuàng)傷修復(fù)、基因治療、細(xì)胞替代治療等方面均具有很好的臨床應(yīng)用價值和廣闊的應(yīng)用前景。臨床上已有MSCs用于治療重度移植物抗宿主?。℅VHD）并發(fā)腸道損傷的報道[29]。在美國已有生物公司完成了對傳統(tǒng)藥物治療無效的CD患者進(jìn)行健康獻(xiàn)血者骨髓干細(xì)胞來源的骨髓基質(zhì)細(xì)胞回輸?shù)蘑蚱谂R床試驗(yàn)。結(jié)果表明治療28d后所有患者的癥狀得到明顯改善。Ⅲ期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中[30]。但是目前為止,還未建立鑒定MSCs的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),MSCs在體內(nèi)的細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)作用機(jī)制尚未完全清楚,MSCs廣泛應(yīng)用于臨床還有許多問題有待解決：如MSCs適宜的移植時機(jī)、安全的移植路徑、移植細(xì)胞的數(shù)量、移植后的細(xì)胞能否長期存活及細(xì)胞移植后是否具有致瘤性等,這些問題的解決均需要更深入的基礎(chǔ)研究和更多的臨床病例研究及更長時間的隨訪。

總之,MSCs移植治療IBD是一個新方向,其多向分化潛能、免疫調(diào)節(jié)作用、營養(yǎng)作用使MSCs移植有望成為IBD治療的有效途徑。

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