吳 劍，曾凡坤，陳飛平

(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715)

酸性水提取柑橘皮渣檸檬苦素工藝

吳 劍，曾凡坤*，陳飛平

(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715)

以使用硫酸調(diào)節(jié)純水得到的酸性水為溶劑，采用高效液相色譜測(cè)定檸檬苦素含量，浸提柑橘皮渣中檸檬苦素。在熱浸提時(shí)間、溫度及料液比單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用三元二次旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取條件，建立三因素與檸檬苦素得率之間的數(shù)學(xué)模型。結(jié)果表明，酸性水提取柑橘皮渣中檸檬苦素的最佳工藝條件為提取時(shí)間2.6h、溫度61.2℃、料水比1∶19.2(g/mL)、酸性水提取液pH4。在此工藝條件下，檸檬苦素的得率為0.117mg/g。

柑橘皮渣；檸檬苦素；提?。恍D(zhuǎn)正交；高效液相色譜

檸檬苦素類似物的主要來(lái)源是蕓香科柑橘屬植物[1]，在幼果中多以苷元的形式存在。在果實(shí)的成長(zhǎng)后期、成熟期檸檬苦素類似物苷元轉(zhuǎn)化為配糖體，這種配糖體化只在果實(shí)及種子中進(jìn)行[2]。隨著果實(shí)不斷發(fā)育，苷元逐步轉(zhuǎn)化為配糖體[3]，在種子中配糖體含量占干質(zhì)量的0.31%～0.87%[4]。隨著對(duì)檸檬苦素類似物生物活性的認(rèn)識(shí)，檸檬苦素類似物的應(yīng)用研究已引起了醫(yī)學(xué)界和食品界的廣泛關(guān)注。檸檬苦素類似物在抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗菌、利尿、抗焦慮，并可以改善睡眠質(zhì)量、降低膽固醇含量、防止動(dòng)脈粥樣硬化等方面都具有顯著效果[5-9]。

國(guó)內(nèi)對(duì)檸檬苦素進(jìn)行系統(tǒng)性研究的為數(shù)不多，就已有的研究成果，大部分是以柑橘種子作為提取材料、有機(jī)溶劑作為提取溶劑。在柑橘加工過(guò)程中，皮渣(去汁后剩余物)是主要副產(chǎn)品，占柑橘總量的20%～40%[10-11]。如要從皮渣中分離種子和其他部分，進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)顯然是不可行的。將鮮榨后的柑橘皮渣進(jìn)行處理后，可以直接提取檸檬苦素或其他生物活性物質(zhì)，這將極大提高工業(yè)化生產(chǎn)的可行性。在水提取基礎(chǔ)上，根據(jù)檸檬苦素在酸性環(huán)境中可以增大其溶出率的原理，并且考慮提取溶劑的回收率與消耗成本，在以工業(yè)化為目標(biāo)的前提下，本實(shí)驗(yàn)以新鮮柑橘皮渣作為提取材料、酸性水作為提取溶劑對(duì)其提取工藝進(jìn)行研究并優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮柑橘(甜橙)榨汁后剩余皮渣，取自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，粗碎備用。

1.2 試劑與儀器

檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.8%) 美國(guó)Simga公司；乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純) 天津四友公司。

ultimate XB-C18(4.6mm×250mm，5μm) 美國(guó)Welch公司；LC-20A型高效液相色譜儀、LC-20A型紫外檢測(cè)器、UV-2450型雙光束紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；AE200型分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；PH-3S型酸度計(jì) 成都方舟科技公司；JQS200DE型超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 高效液相色譜條件[12]

色譜柱：Welch ultimate (250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：乙睛-超純水(45∶55，V/V)；流速 1.0mL/min；柱溫25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)200nm；進(jìn)樣量5μL。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與得率計(jì)算方法

稱取檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品6.7mg，用色譜純乙腈溶解并定容于25mL容量瓶，配制成質(zhì)量濃度0.0134mg/mL的檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)溶液，貯存于4℃?zhèn)溆?。?jīng)雙光束紫外分光光度計(jì)掃描后，確定最大吸收波長(zhǎng)為200nm，此后實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)波長(zhǎng)定為200nm。

精確量取1、2、3、4、5mL檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)母液置于5個(gè)10mL容量瓶，分別向各容量瓶中加乙腈稀釋并定容于10mL，制成一系列梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。經(jīng)0.45μm有機(jī)濾膜后以進(jìn)樣量為5μL經(jīng)液相色譜分析檢測(cè)，記錄色譜圖，以峰面積為橫坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得曲線方程為Y=3×10-7X-0.0005(R2=0.9996)，檢出限為0.001～0.05mg/mL。

式中：c為經(jīng)過(guò)計(jì)算提取液中檸檬苦素的質(zhì)量濃度/ (mg/mL)；v為提取液的總體積/mL；m為取樣的質(zhì)量/g。

1.5 檸檬苦素提取工藝流程

柑橘皮渣粗碎→60～90℃石油醚脫脂→稱量→酸性水熱提取→過(guò)濾→高效液相色譜檢測(cè)

1.6 樣品檢測(cè)

稱取脫脂皮渣5.0g，加入酸性提取液，按提取工藝條件在熱水浴提取，過(guò)濾并收集濾液，取各組處理提取液2mL經(jīng)針式過(guò)濾頭(有機(jī)系，0.45μm)過(guò)濾后，裝入自動(dòng)進(jìn)樣瓶。按色譜條件自動(dòng)進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖，計(jì)算色譜峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度。對(duì)檸檬苦樣標(biāo)準(zhǔn)品與提取樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖1?？梢钥闯鰳悠分袡幟士嗨乇Ａ魰r(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖中的保留時(shí)間一致，可以判斷為檸檬苦素。

圖1 檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品與樣品色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of limonin standard and sample

1.7 酸性水提取檸檬苦素單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

使用硫酸、鹽酸、醋酸、檸檬酸調(diào)節(jié)純水pH值，以相同pH值的純水作為提取溶劑，確定最高得率的溶劑；確定最佳提取溶劑后，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，試驗(yàn)水平為：pH2.5、3、3.5、4、4.5、5、10；提取時(shí)間0.5、1、2、3、4h；提取溫度20、40、50、60、70、80、90℃；料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶18、1∶20 (g/mL)，確定提取時(shí)間、溫度、料液比的最佳條件，提取液中檸檬苦素得率按1.2.5節(jié)方法測(cè)定并計(jì)算得率。試驗(yàn)初始提取條件為溫度50℃、料液比1∶10、提取時(shí)間1.5h，此后完成一個(gè)最佳因素替換一個(gè)以此類推。1.8優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以檸檬苦素得率為響應(yīng)值，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取酸性水提取時(shí)間、料液比以及提取溫度為影響因素，采用三元二次旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)[13]優(yōu)化試驗(yàn)，確定提取效率最佳的組合條件。在三元二次旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，分別用X1、X2、X3依次表示料液比、提取溫度和提取時(shí)間，以γ、1、0、-1、-γ分別表示各因素的5個(gè)水平。根據(jù)SAS統(tǒng)計(jì)分析軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平編碼設(shè)計(jì)見表1(以檸檬苦素得率為指標(biāo)評(píng)價(jià)提取效果)。

表1 三元二次旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平編碼表Table 1 Factors and levels in the quadratic rotary unitization design

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類酸性水對(duì)提取柑橘皮渣中檸檬苦素得率的影響

由圖2可知，在本體系中無(wú)機(jī)酸浸提檸檬苦素能力要強(qiáng)于有機(jī)酸。無(wú)機(jī)酸中硫酸提取得率高于鹽酸，推測(cè)在加熱情況下促進(jìn)了鹽酸揮發(fā)速率，使得酸性水的酸性發(fā)生變化，而硫酸酸性水并不存在這個(gè)問(wèn)題。并且硫酸使用廣泛并易得，符合試驗(yàn)選擇常見廉價(jià)提取液藥品的原則，選擇硫酸做調(diào)節(jié)純水pH值的藥品。

圖2 不同酸性溶液對(duì)檸檬苦素提取得率的影響Fig.2 Effect of different acids on limonin yield

2.2 酸性水溶液pH值對(duì)提取柑橘皮渣中檸檬苦素得率的影響

圖3 不同pH值酸性水溶液對(duì)檸檬苦素提取得率的影響Fig.3 Effect of water pH on limonin yield

由圖3可知，提取溶劑pH2～4時(shí)，提取率相應(yīng)增加，pH4時(shí)提取率最大，之后隨著pH值增加，提取率下降，因此試驗(yàn)中選擇pH4的酸性水溶液作為提取劑。

2.3 提取時(shí)間對(duì)提取柑橘皮渣中檸檬苦素得率的影響

圖4 提取時(shí)間對(duì)檸檬苦素得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on limonin yield

由圖4可知，提取時(shí)間不超過(guò)3h時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，檸檬苦素得率呈上升趨勢(shì)，超過(guò)2h后，基本趨于平緩；當(dāng)時(shí)間超過(guò)3h時(shí)，得率又下降，可能因熱處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，檸檬苦素被水中分子氧破壞所引起。綜合考慮得率及提取效率，試驗(yàn)選取最佳提取時(shí)間為2.5h。

2.4 溫度對(duì)提取柑橘檸檬苦素得率的影響

應(yīng)該指出，對(duì)于軸瓦開有多槽形式，主要是考慮多槽在軸承圓周方向不同角度的布置對(duì)軸承工作性能的影響，本文的后續(xù)工作將陸續(xù)展開。

圖5 溫度對(duì)檸檬苦素得率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on limonin yield

從圖5可知，溫度在40～70℃之間時(shí)，隨著提取溫度的增加，檸檬苦素得率逐漸升高，溫度升高到60℃后，檸檬苦素的得率增長(zhǎng)趨于平緩。檸檬苦素因其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，十分容易被氧化，在加熱條件下與水中氧分子碰撞結(jié)合的概率也相應(yīng)增加，溫度的升高有利于提高提取效率，但也會(huì)增加檸檬苦素被氧化的概率。檸檬苦素具有生物活性，提取溫度過(guò)高會(huì)破壞其化學(xué)結(jié)構(gòu)，因此選取60℃為最佳的提取溫度。

2.5 料液比對(duì)提取柑橘檸檬苦素得率的影響

圖6 料水比對(duì)檸檬苦素得率的影響Fig.6 Effect of solid-to-liquid ratio on limonin yield

由圖6可知，隨著加水量的增加，檸檬苦素得率逐漸升高，當(dāng)加水量大于取樣量15倍之后，得率變化不大。再增加加水量，反而使得率降低，可能提取溶液量多并且提取液中檸檬苦素濃度較低，在此濃度液相色譜檢測(cè)靈敏度下降，造成檸檬苦素得率下降的假象。因此綜合考慮溶劑用量與提取后濃縮純化工藝，選取1∶18為最佳料液比。

2.6 優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析

優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見表2，以檸檬苦素得率為響應(yīng)值，采用SAS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行多元回歸分析[14]，得到初步回歸方程為：Y=0.115164＋0.003039X1＋0.012984X2＋0.005412X3-0.019563X12-0.002125X1X2-0.000375X1X3-0.007896-0.001125X2X3-0.017265。

2.6.1 回歸模型分析

經(jīng)SAS進(jìn)行多元回歸分析后，對(duì)回歸方程進(jìn)行逐項(xiàng)顯著性評(píng)價(jià)，結(jié)果表明除X1X2、X1X3、X2X3項(xiàng)不顯著之外，其余各項(xiàng)均顯著，其中X2、、項(xiàng)達(dá)到極顯著。SAS軟件計(jì)算時(shí)，已將各項(xiàng)回歸系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化，因此根據(jù)3個(gè)因素的絕對(duì)值大小判斷影響因素的主次。在酸性水提取條件下，影響因素主次為溫度＞時(shí)間＞料液比。

對(duì)不顯著項(xiàng)利用SAS軟件中GLM Procedure逐步回歸，將不顯著項(xiàng)并入誤差項(xiàng)，得到優(yōu)化后的回歸方程：Y=0.115164＋0.003068X1＋0.012954X2＋0.005441X3-0.019553-0.007886-0.017255。R2值為95.81%，修正決定系數(shù)為92.91%，此二項(xiàng)表明試驗(yàn)方法可靠，可以良好的描述試驗(yàn)結(jié)果，可用于分析柑橘皮渣中檸檬苦素提取試驗(yàn)。

表2 檸檬苦素提取旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)矩陣及結(jié)果Table 2 Quadratic rotary unitization design and corresponding experimental results

2.6.2 方差分析

試驗(yàn)結(jié)果方差分析見表3。結(jié)果表明P＜0.0001，回歸方程模型達(dá)到極顯著水平，而誤差項(xiàng)不顯著。因此，該回歸方程擬合性好。一次項(xiàng)與二次項(xiàng)對(duì)檸檬苦素提取得率有極顯著影響，交互項(xiàng)對(duì)檸檬苦素得率影響不明顯，有95.81%的響應(yīng)值變化來(lái)源于所選變量。

表3 方差分析結(jié)果表Table 3 Primary variance analysis for the established regression model

經(jīng)過(guò)GLM Procedure逐步回歸后的方差分析結(jié)果見表4。結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)合并不顯著項(xiàng)后，回歸模型為極顯著。

表4 GLM回歸分析優(yōu)化后模型的方差分析Table 4 Variance analysis for the established regression model after GLM Procedure regression

圖7 各兩因素交互作用對(duì)檸檬苦素得率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots showing effects of pH, extraction time and temperature on limonin yield

從圖7響應(yīng)面圖與等高線圖所可看出，在其中一項(xiàng)固定為0水平時(shí)，另外二項(xiàng)的增加都會(huì)使得檸檬苦素得率先升后降，并達(dá)到最高值。當(dāng)提取時(shí)間和料水比各自固定為0水平時(shí)，檸檬苦素得率隨提取溫度的變化幅度較大，并且得率達(dá)到極大值。而得率隨著提取時(shí)間與料水比的變化時(shí)幅度不及溫度，提取溫度的改變對(duì)得率影響較大。利用SAS軟件中RSREG程序處理后得到3個(gè)因素的最優(yōu)值分別為提取時(shí)間2.6h、溫度61.2℃、料液比1∶19.2(g/mL)以及酸性水提取液pH4。在此條件下，預(yù)測(cè)檸檬苦素得率響應(yīng)值為0.120mg/g。

2.6.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

以最優(yōu)條件作為一組處理進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，得到的檸檬苦素平均得率為0.117mg/g，與理論預(yù)測(cè)值接近，重復(fù)性好。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化后得到的提取條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際價(jià)值。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)將酸性水提取法與響應(yīng)面分析法結(jié)合，采用新鮮柑橘皮渣為原料，以硫酸溶液調(diào)節(jié)純水pH值至4為提取溶劑，并優(yōu)化了柑橘皮渣中檸檬苦素的提取工藝條件。經(jīng)優(yōu)化后的酸性水提取柑橘皮渣中檸檬苦素的最佳提取條件為提取時(shí)間2.6h、溫度61.2℃、料水比1∶19.2 (g/mL)以及酸性水提取液pH4。在此條件下，檸檬苦素得率為0.117mg/g。與前人研究使用乙醇提取柑橘果皮和種子中含檸檬苦素64mg/kg和200～300mg/kg(本實(shí)驗(yàn)中皮渣中既有種子也有果皮)結(jié)果[15]基本符合。因使用硫酸調(diào)節(jié)純水pH值，與有機(jī)溶劑相比價(jià)格低廉，提取效果較好，提取液的酸較弱，除污簡(jiǎn)單，污染環(huán)境可能性小，對(duì)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)有指導(dǎo)意義。柑橘皮渣中水溶性物質(zhì)較多，在提取液中雜質(zhì)含量也較高，如何在提取后將雜質(zhì)去除，是今后需重點(diǎn)關(guān)注與研究的方向。

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Process Optimization for Acidic Water Extraction of Limonin from Citrus Peels by Response Surface Methodology

WU Jian，ZENG Fan-kun*，CHEN Fei-ping (College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

The pH of pure water was adjusted with sulfuric acid to provide a solvent for the extraction of limonin from citrus peels. Limonin quantification was performed by HPLC. Based on one-factor-at-a-time experiments, a three-variable quadratic rotary unitization design combined with response surface methodology was used to optimize three conditions for acidic water extraction of limonin from citrus peels, and a mathematical model describing limonin yield versus the three extraction conditions was built. The optimal extraction conditions of limonin from citrus peels were 2.6 h extraction at 61.2 ℃, pH 4 and a solid-toliquid ratio 1∶19.2 (g/mL). Under the optimized conditions, a limonin yield of 0.117 mg/g was achieved.

citrus peels；limonin；extraction；quadratic rotary unitization design；high performance liquid chromatography

TS209

A

1002-6630(2011)14-0006-05

2010-07-23

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2007BAD47B06-4)

吳劍 (1985—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称饭こ?。E-mail：wj851031@yahoo.com.cn

*通信作者：曾凡坤(1963—)，男，教授，研究方向?yàn)楣呒庸?。E-mail：zengfankun@swu.edu.cn