伍海鷹，宮曉光，黃 海，王保春

（海南省人民醫(yī)院普外一科，海南 ?？?570311）

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，惡性程度比較高，發(fā)病多比較隱匿，在臨床發(fā)現(xiàn)時多已為中晚期，且治療比較困難，預后比較差，傳統(tǒng)的化療藥物仍存在特異性比較差、毒副作用強、多易產(chǎn)生耐受性、價格昂貴等缺點，因而研究開發(fā)特異性高、低毒、不易產(chǎn)生耐受性、價格低廉的抗癌藥，具有較大的實際應用價值。我們通過建立小鼠肝癌模型，應用草蓯蓉根莖多糖治療，研究其對肝癌的治療作用。

1 材料與方法

1.1 動物和分組 健康雄性SD大鼠72只，體重250～280 g，通過皮下注射肝癌細胞建立小鼠肝癌模型，由海南省人民醫(yī)院實驗動物中心提供，隨機分成3組：（1）對照組+生理鹽水組；（2）模型組±生理鹽水組；（3）模型組+草蓯蓉根莖多糖組。每組術(shù)后再隨機分設1個月、2個月、3個月3個時相點，每個時相點8只。

1.2 檢測方法和觀察內(nèi)容 分別于術(shù)后1個月、2個月、3個月取材。（1）計算瘤重；（2）肝癌細胞內(nèi)丙二醛(MDA)、超氧化歧化酶(SOD)按試劑盒說明書進行操作測定；（3）試劑盒測定血液腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平。

2 結(jié)果

2.1 瘤重測定結(jié)果 瘤重值在膽管梗阻1個月時模型組比草蓯蓉根莖多糖組升高非常明顯（1個月，P＜0.01)，2個月時模型組比草蓯蓉根莖多糖組升高較明顯，差異有統(tǒng)計學意義（2個月，P＜0.05），而3個月時兩組均明顯升高，差異無統(tǒng)計學意義（3個月，P＞0.05）。

2.2 肝癌細胞內(nèi)MDA測定 肝癌細胞內(nèi)MDA顯著升高，隨著時間的遷延升高更明顯。草蓯蓉根莖多糖治療后，1個月、2個月時草蓯蓉根莖多糖組比模型組MDA顯著降低（1個月，P＜0.01；2個月，P＜0.05），但3個月時，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 肝癌細胞內(nèi)SOD測定 肝癌細胞內(nèi)顯著降低，隨著時間的遷延降低更明顯。草蓯蓉根莖多糖治療后，草蓯蓉根莖多糖組比模型組SOD顯著升高（7 d，P＜0.01)；2個月時草蓯蓉根莖多糖組比模型組SOD顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（14 d，P＜0.05），而3個月時兩組均降低明顯，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.4 血液TNF-α水平測定結(jié)果 血液內(nèi)TNF-α水顯著降低，隨著時間的遷延降低更明顯。草蓯蓉根莖多糖治療后，草蓯蓉根莖多糖組比模型組TNF-α顯著升高（7 d，P＜0.01)；2個月時草蓯蓉根莖多糖組比模型組SOD顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（14 d，P＜0.05），而3個月時兩組均降低更明顯，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，惡性程度比較高，發(fā)病多比較隱匿，臨床發(fā)現(xiàn)時多已為中晚期；且治療比較困難，預后比較差，因此被稱為“癌中之王”。原發(fā)性肝癌的發(fā)病率在全球所有惡性腫瘤中排第6位，而死亡率則排第3位[1]。有資料統(tǒng)計表明，全球每年新發(fā)肝癌患者中（626000人），有大約55%的病例發(fā)生在中國[2]。我國肝癌多高發(fā)于江蘇、浙江、福建、廣東和廣西等東南沿海地區(qū)。通過流行病學調(diào)查顯示，在我國每年原發(fā)性肝癌患者約有12萬死亡，年死亡率占惡性腫瘤年死亡率的第2位，大約占全世界肝癌死亡總?cè)藬?shù)的42.5%[3]。據(jù)統(tǒng)計肝癌死亡率1990年占腫瘤死亡率的位次已由過去的第3位上升為第2位。在城市僅次于肺癌，而在農(nóng)村僅次于胃癌，且近年來其發(fā)病率有增高的趨勢，發(fā)病年齡亦趨于年輕化[4]。原發(fā)性肝癌起病多比較隱匿，在早期診斷率比較低，遠處轉(zhuǎn)移早，并且對多種化療藥物不敏感，復發(fā)率和死亡率較高。70%～80%的患者在發(fā)現(xiàn)時已失去手術(shù)機會。盡管近年來手術(shù)和介入治療技術(shù)取得了長足的進步，但總體效果仍不盡人意，手術(shù)后5年生存率僅20%～40%。在我國，由于原發(fā)性肝癌患者多同時伴有不同程度的肝硬化，確診時多因肝硬化從而不能耐受手術(shù)而喪失切除機會。并且傳統(tǒng)的化療藥物仍存在特異性比較差、毒副作用強、多易產(chǎn)生耐受性、價格昂貴等缺點，因而研究開發(fā)特異性高、低毒、不易產(chǎn)生耐受性、價格低廉的抗癌藥具有較大的實際應用價值。

多糖是構(gòu)成生命的四大物質(zhì)之一，由醛糖或酮糖通過糖苷鍵相連接而形成的一類大分子聚合物。來源比較廣泛，多存在于高等植物、動物、微生物、地衣和海藻中。多糖不僅是生物的主要結(jié)構(gòu)成分，而且還具有復雜的生物活性與功能。多糖的抗腫瘤機制主要有：直接抑制腫瘤細胞，通過調(diào)節(jié)機體的免疫系統(tǒng)的功能達到殺傷腫瘤的目的；通過抗突變、抗遺傳損傷、抗氧化清除自由基，從而抑制腫瘤的增殖分化，誘導腫瘤細胞調(diào)亡[5-6]。多糖抗肝癌機制是多方位、多環(huán)節(jié)的。多糖類化合物結(jié)構(gòu)比較復雜，構(gòu)效關系現(xiàn)在尚未找到固定的規(guī)律，從而給研究造成了一定困難。我們可以通過現(xiàn)代分子生物學的研究進展以及對多糖作用機制的進一步揭示，借助先進的分離和多樣的分析技術(shù)，對多糖進行深入研究和開發(fā)利用。草蓯蓉多糖是草蓯蓉的重要化學成分之一，其含量占植物重量的12.74%，是我國東北地區(qū)特有的國家二級珍稀藥用植物。草蓯蓉多糖具有多種活性，如增強免疫力、抗衰老、抗癌、消炎等[7-9]。有研究表明[10-11]，草蓯蓉多糖能明顯增加小鼠脾臟對綿羊紅細胞的特異性抗體的生成細胞數(shù)，增強B細胞對細菌脂多糖的增生反應，促進小鼠脾細胞產(chǎn)生白介素-2，提高小鼠免疫功能。據(jù)報道[12]，草蓯蓉提取物具有增強肝枯否細胞的吞噬，誘導肝臟清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化和大鼠癌前病變等功效，因此推測草蓯蓉多糖也具有抗肝癌作用。目前人們對草蓯蓉多糖的應用研究報道較少，其中對其根莖多糖的研究更未見報道，隨著草蓯蓉藥用和經(jīng)濟價值的體現(xiàn)，對其多糖的深入研究十分必要。特別是近來由于其生活方式特殊，分布量少，再加上掠奪式采集，使草蓯蓉資源數(shù)量愈來愈少。因此，為了保護和利用這一寶貴資源，對草蓯蓉多糖活性的系統(tǒng)研究更為迫切。在20世紀80年代，由于生物調(diào)節(jié)劑的被提出，多糖抗腫瘤研究就進入了一個全新時代。研究證實多糖在治療腫瘤中減輕了臨床癥狀，提高了患者的生存質(zhì)量，抑制了腫瘤的復發(fā)轉(zhuǎn)移；在與放化療配合中，起到了增效、減毒等作用。本文通過建立小鼠體內(nèi)移植性肝癌模型，對草蓯蓉根莖多糖的抗肝癌作用及其免疫機制進行研究，為進一步開發(fā)高效無毒的抗肝癌新藥奠定實驗基礎。

本實驗結(jié)果顯示，肝癌發(fā)展的不同時期肝臟免疫機制明顯異常，肝癌細胞內(nèi)SOD和血液TNF-α水平降低，隨著病程進展，肝癌瘤重隨之加重。用草蓯蓉根莖多糖治療后，小鼠肝癌細胞內(nèi)SOD和血液TNF-α水平在1個月、2個月時明顯高于對照組（模型組+生理鹽水組和模型組+草蓯蓉根莖多糖組相比，1個月，P＜0.01；2個月，P＜0.05），而且使MDA的含量降低，肝癌細胞內(nèi)氧化應激明顯減輕。因此可以說明草蓯蓉根莖多糖可抑制脂質(zhì)過氧化反應，從而減輕肝癌時的肝損傷。同時草蓯蓉根莖多糖使TNF-α升高，而TNF-α是由巨噬細胞產(chǎn)生的一類重要免疫細胞因子，具有廣泛的生物學活性。其抗腫瘤機制有以下幾個方面：①通過TNF-α誘導的腫瘤局部的炎癥反應在腫瘤壞死反應中起作用。②TNF-α通過誘導B淋巴細胞的成熟，從而增強對免疫原性腫瘤的消退；進而誘導NK細胞毒性作用大大增高；使干擾素大量產(chǎn)生，間接發(fā)揮了抗腫瘤活性，并誘導白細胞介素的產(chǎn)生。③TNF-α通過對毛細血管內(nèi)皮細胞的直接毒作用，導致血管的損傷，引起腫瘤的出血性壞死。④TNF-α可以使血管阻塞從而導致腫瘤的缺血壞死。⑤TNF-α具有對腫瘤細胞直接的細胞毒及抑制腫瘤細胞生長作用。由此可見，TNF-α是激活機體免疫反應的重要分子，可通過多種免疫途徑，最大限度地選擇性殺傷腫瘤細胞[13-15]。

此外，本實驗還顯示用草蓯蓉根莖多糖治療肝癌至3個月后，模型組+生理鹽水組和模型組+草蓯蓉根莖多糖組中MDA都進一步增高，但兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；SOD和血液TNF-α水平減少減緩，但兩組相比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。這提示草蓯蓉根莖多糖只能在肝癌的早、中期通過減少自由基的產(chǎn)生，減輕脂質(zhì)過氧化損傷，提高機體免疫力，起到抗肝癌作用，減輕肝臟損傷的作用，但在晚期抗肝癌效果較差，這就需要我們進一步尋找更有效的抗肝癌藥物。

[1]Parkin DM,Bray F,Ferlay J,et a1.Global cancer statistics 2002[J].CA Cancer J Clin,2005,55(2):74-108.

[2]Bray F,Sankila R,Ferlay J,et a1.Estimates of cancer incidence and mortality in Europe in 1995[J].Eur J Cancer,2002,38(1):99-166.

[3]Neuzil J,Weber T,Gellert N,et a1.Selective cancer cell killing by alphatocophery succinate[J].BrJ Cancer,2001,84(1):87-89.

[4]陳建國,宋新明．中國肝癌發(fā)病水平的估算與分析[J].中國腫瘤,2005,14（5）:302-306．

[5]楊 敏.多糖抗腫瘤機制的研究進展[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志,2002,12(6):27-30.

[6]鄭 敏.中藥多糖抗腫瘤的藥理學研究進展[J].國外醫(yī)學中醫(yī)中藥分冊,2000,5(22):79-81.

[7]梁 敏,卜秀玲,劉 瑛.草蓯蓉多糖研究進展[J].食品與藥品,2009,11（9）:65.

[8]侯 元,霍德勝,魏艷君,等.草蓯蓉多糖的抗腫瘤作用及免疫調(diào)節(jié)作用[J].吉林大學學報（醫(yī)學版）,2007,33（6）:1022-1025.

[9]費 瑞,遲立超,杜建石,等.草蓯蓉多糖的毒性實驗研究[J].東北師大學報（自然科學版）,2008,40（2）:98-100.

[10]張慶鎬,李英信,李紅花,等.草蓯蓉多糖對小鼠體液免疫功能的影響[J].延邊大學醫(yī)學學報,1999,22（1）:26-28.

[11]張慶鎬,李紅花,魏成淑,等.草蓯蓉多糖對小鼠白細胞介素-2產(chǎn)生的影響[J].延邊大學醫(yī)學學報,2000,23（1）:37-38.

[12]沈明花,尹宗柱,金 明,等.草從蓉提取物對二乙基亞硝胺誘發(fā)的肝癌前病變大鼠血清超氧化物岐化酶活性及丙二醛含量的影響[J].延邊大學醫(yī)學院學報,1998,21(4):206-208.

[13]劉鳳龍，張宏斌，施定生，等.α型人腫瘤壞死因子基因在魚腥藻7120中的表達及初步純化[D].廣東華南理工大學,1998.

[14]Raulet DH.Development and tolerance of natural killer cells[J].Current Opinion in Immunology,1999,11:129-134.

[15]Biron CA,Nguyen KB,Pien GC,et al.Natural killer cells in antiviral defense and function and regulation by innate cytokines[J].Immunity,1999,17:189-220.