杜銀香

湖北民族學院醫(yī)學院(湖北 恩施 445000)

霉菌的形態(tài)結構觀察是微生物實驗教學的一個重要內容，也是對霉菌進行分類鑒別的重要依據(jù)之一。觀察霉菌形態(tài)的方法主要有直接制片觀察法、載玻片培養(yǎng)觀察法和玻璃紙培養(yǎng)觀察法[1]。以往我們觀察標本時多采用直接制片觀察法中的水浸片，因為有液體的存在，故標本片保存的時間有限。我們在長期的實驗教學中發(fā)現(xiàn)了一種簡便的、可以長時間保存的、也很容易大批量制作霉菌標本片的方法，特介紹如下。

1 材料與方法

1.1材料(1)菌種：總狀毛霉(來源于腐乳中，經(jīng)分離鑒定為總狀毛霉)。 (2)培養(yǎng)基：沙氏瓊脂(生產(chǎn)批號20100520 杭州微生物試劑有限公司)。(3)儀器設備及其他：生物安全柜(Ⅱ級AC2-4S1 ESCO公司生產(chǎn)) ，恒溫恒濕培養(yǎng)箱(型號XMT-9017重慶永恒實驗儀器廠生產(chǎn))，普通光學顯微鏡(型號BM1000 南京江南永新光學有限公司生產(chǎn))，加拿大樹膠、載玻片、蓋玻片、眼科鑷、解剖針等 。

1.2 方法

(1)玻片的清洗：新的載玻片、蓋玻片因含游離堿，應先在1%鹽酸溶液中浸泡24 h后，再用自來水沖洗干凈，晾干后使用。

(2)結晶紫染液的配制：先稱取結晶紫4～8 g，溶于95%乙醇100 mL中，制成結晶紫飽和液，再取此飽和液20 mL與1%草酸銨溶液80 mL混合，過濾后使用。

(3)菌種的準備：在生物安全柜內，利用孢子很容易飛散的特點，直接將長有總狀毛霉的平板倒扣在需要接種的沙氏瓊脂平板上，輕輕地敲擊幾下菌種平板，使孢子落到下面的平板上，放入溫度25℃、濕度80%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后取出，看到氣生菌絲呈白色，長約10 mm左右即可。

( 4)制片:在載玻片上1/3與2/3交界處滴加一滴生理鹽水后，再用滅菌冷卻后的眼科鑷夾取突出在培養(yǎng)基表面的菌絲少許，輕輕地放入生理鹽水中，用解剖針將菌絲分散開后，放空氣中自然干燥或置25℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱使其干燥。

(5)染色:采用單染法，用結晶紫染液染色1 min后，水洗，灑去載玻片上多余的水份后，讓其自然干燥或置25℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱使其干燥，待完全干燥后，蓋上蓋玻片，四周用加拿大樹膠封片。

1.3結果在普通光學顯微鏡下可見孢囊梗及孢子囊、孢子囊孢子均成紫色。孢囊梗無橫隔膜，最初不分枝，以后分枝，分枝長短不一，各分枝頂端均有孢子囊。 孢子囊呈球形，嫩孢子囊較小，染色較淺，成熟孢子囊較大，染色較深，還可見有些成熟孢子囊孢囊壁已經(jīng)消解。孢子囊孢子呈卵形，表面光滑。

2 體會

2.1菌種準備時注意事項

(1)培養(yǎng)的溫度：溫度會影響菌絲的生長和代謝。在實踐中我們發(fā)現(xiàn)如果取氣生菌絲制作霉菌標本片，一般溫度在25℃比較合適，在這個溫度下培養(yǎng)48 h左右的氣生菌絲較長，容易取材，并且孢子囊孢子的成熟度也不高。如溫度過低，則菌絲生長太過緩慢，整個制作過程花費時間會太長。如溫度過高，則菌絲會很快老化、死亡，產(chǎn)生的孢子囊孢子很快就會成熟破裂，大量孢子會釋放出來，且附著在菌絲上，影響菌絲結構的觀察。

(2)培養(yǎng)基的選擇:我們在實驗時發(fā)現(xiàn),如果用培養(yǎng)細菌的營養(yǎng)瓊脂去培養(yǎng)總狀毛霉，總狀毛霉的氣生菌絲始終只有1～2 mm，不會太長，不適合取標本。營養(yǎng)瓊脂和沙氏瓊脂主要區(qū)別在于培養(yǎng)基的pH值不一樣，前者pH為7.4左右，而后者的pH為6.0左右，pH也是影響菌絲的生長的一個重要因素，因此我們一般用沙氏瓊脂來培養(yǎng)總狀毛霉。

(3)氧氣：總狀毛霉在氧氣充足的情況下氣生菌絲生長良好。我們一般用沙氏瓊脂平板來培養(yǎng)總狀毛霉，并且培養(yǎng)時培養(yǎng)皿正立，培養(yǎng)皿的蓋與底部之間留一絲縫隙，讓其生長時氧氣充足。

2.2制片注意要點

(1)盡量取呈白色的氣生菌絲，不可用有黑點太多的菌絲，黑點太多，則說明產(chǎn)生的孢子囊孢子大多已經(jīng)快成熟了，稍一接觸菌絲，這些孢子囊會破裂。

(2)取菌絲時盡量取長一點，從接近培養(yǎng)基基質的地方開始取，菌絲不可取得太多，取得太多的話，菌絲很容易糾纏在一起，不容易分散開。

(3)菌絲放入到生理鹽水中后就盡量不要去攪動它，否則大量的孢子囊也會破裂。

(4)載玻片上的生理鹽水放得稍稍多一點，這樣菌絲也就很容易浮在生理鹽水的表面，菌絲自然就分散開了。

(5)制片時不能加熱固定，加熱后菌絲和孢子都會變形。

2.3染料的選擇染色時我們嘗試用細菌染色時常用的染料結晶紫和石炭酸復紅分別進行單染，結果發(fā)現(xiàn)用石炭酸復紅單染后菌絲和孢子都著色，但菌絲細胞收縮變形了，原因不明，有待進一步研究。用結晶紫單染的菌絲和孢子都著色，形態(tài)和用乳酸酚棉藍染色后的效果沒有區(qū)別，因此我們選擇了用結晶紫染液。

2.4其他注意事項染色后水洗時一定注意不可直接打開水龍頭沖洗，否則很容易將玻片上的菌絲及孢子沖掉。我們是將玻片輕輕地放入裝有水的容器中，讓水把紫色的染料慢慢地褪掉，看到?jīng)]有紫色褪下即可；結晶紫染液配置好后一定要過濾，否則雜質易沾到標本片上，影響霉菌形態(tài)結構的觀察；標本片的制備過程中需要注意生物安全，接種和制片時都需要在生物安全柜內進行。

[1] 曾松榮.細菌、霉菌玻片標本的制作技巧[J].生物學通報,2004,39(4)：52.