李 婧，連永權(quán)，李 范，劉保東＊

（1 哈爾濱師范大學(xué) 黑龍江省普通高等學(xué)校植物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150025；2 黑龍江職業(yè)學(xué)院，哈爾濱150111）

水韭科（Isoetaceae）是古老的孑遺擬蕨類水生植物，全球零散分布約250種，多為珍稀瀕危保護(hù)物種［1］，中國(guó)僅5種水韭，且均為特產(chǎn)種［2］。由于生存環(huán)境不斷惡化，野生數(shù)量減少，全科均被列為國(guó)家一級(jí)保護(hù)物種［3］。中華水韭（Isoetes sinensis）曾是長(zhǎng)江中下游濕地常見蕨類，對(duì)自然環(huán)境變化較為敏感［4］，隨著近幾十年該地區(qū)經(jīng)濟(jì)活動(dòng)的快速發(fā)展，數(shù)量急劇下降，已列為國(guó)家極危級(jí)（CR）保護(hù)物種［5］。He通過細(xì)胞學(xué)研究指出減數(shù)分裂過程中染色體的行為變化可能是有性生殖的限制因素，但不是種群數(shù)量下降的主要原因；陳進(jìn)明等［7］就中華水韭的遺傳多樣性進(jìn)行分析，認(rèn)為遺傳結(jié)構(gòu)是限制種群發(fā)展的主要成因之一；中華水韭對(duì)溫度這一古老因素具有抗性［8］，對(duì)現(xiàn)代常用除草劑的抗性較低［9］；邢建嬌等［10］通過人工繁殖和栽培指出培養(yǎng)基質(zhì)是其瀕危的重要原因；李范［11］提出中華水韭在發(fā)育幼期是有緣膜存在的，隨著植株生長(zhǎng)而逐漸消失。迄今為止，尚未有中華水韭孢子囊發(fā)育過程以及發(fā)育特征與瀕危關(guān)系等方面的相關(guān)報(bào)道。

孢子囊作為蕨類植物無性生殖的唯一場(chǎng)所，蘊(yùn)涵著大量保守而穩(wěn)定的系統(tǒng)學(xué)信息［12］，分子生物學(xué)也認(rèn)為孢子囊是蕨類植物重要的溯祖形態(tài)［13］。真蕨亞門的經(jīng)典分類包括厚囊蕨綱、薄囊蕨綱和原始薄囊蕨綱，孢子囊是分綱的主要依據(jù)；不少目或科的分類也主要依據(jù)孢子囊的特征，如著生方式、環(huán)帶的有無、開裂方式等［14］。就卷柏屬（Selaginella）而言，孢子囊也有重要的系統(tǒng)學(xué)和生殖生物學(xué)參考價(jià)值，劉保東等在研究24種卷柏的孢子囊排布規(guī)律后指出，大小孢子囊的著生位置和數(shù)量既能反映出物種間的親緣關(guān)系，又與有性生殖能力有關(guān)［15］。

水韭科（Isoetaceae）與卷柏科（Selaginellaceae）同屬石松亞門（Lycophytina）。兩者大孢子囊和小孢子囊分別著生在不同葉片的基部［13］，水韭偶爾還會(huì)出現(xiàn)混生型孢子囊［16］，葉舌的結(jié)構(gòu)也遠(yuǎn)比卷柏類復(fù)雜［11］，孢子囊的發(fā)育特征應(yīng)具有較高的系統(tǒng)學(xué)研究?jī)r(jià)值［17］；國(guó)產(chǎn)水韭中，中華水韭瀕危程度最高，盡管瀕危原因尚不明確，但孢子囊的發(fā)育直接決定著孢子的數(shù)量和質(zhì)量［18］，是中華水韭無性生殖的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)用半薄切片法，連續(xù)觀察了中華水韭大小孢子囊的發(fā)育過程，從無性生殖的角度為探討其瀕危原因提供直觀可靠的理論證據(jù)，也為研究水韭類的親緣關(guān)系提供保守而穩(wěn)定的溯祖形態(tài)。

1 材料和方法

實(shí)驗(yàn)材料中華水韭（Isoetes sinensis）原產(chǎn)浙江省華頂山，由浙江大學(xué)丁炳揚(yáng)教授采集并贈(zèng)送活體植株，經(jīng)劉保東［19］人工繁殖并栽培在哈爾濱師范大學(xué)蕨類培養(yǎng)室（126°42′E，45°24′N）。取個(gè)體發(fā)育不同階段的人工繁殖栽培苗，在解剖鏡下檢查孢子囊的發(fā)育情況以及與葉片的關(guān)系。切取不同發(fā)育程度的孢子囊，用FAA 固定并經(jīng)過常規(guī)半薄切片，在Olympus BH－2型光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

將成熟且完好的小孢子囊，放在10 mL 量筒內(nèi)，滴加約5 mL 蒸餾水后，在水中將小孢子囊挑破，取出孢子囊碎片，定容至10 mL 并搖動(dòng)成均勻懸濁液，吸取1mL懸濁液再稀釋至10mL，以此連續(xù)稀釋數(shù)次后，用移液器吸取0．01mL 滴加在載玻片上，置顯微鏡記錄全部小孢子的數(shù)量后，換算出小孢子囊中小孢子的總數(shù)。將成熟且完好的大孢子囊直接置于載玻片的一滴蒸餾水中，挑破孢子囊壁，直接記錄大孢子的數(shù)量。大小孢子囊的孢子產(chǎn)量均取隨機(jī)檢測(cè)10個(gè)數(shù)值的平均值。

2 觀察結(jié)果

2．1 大小孢子囊的發(fā)育節(jié)律及其孢子產(chǎn)量

中華水韭在個(gè)體發(fā)育初期的1～20枚葉片上，均無孢子囊著生，約20枚葉片后，每枚葉片的基部近軸面均著生1個(gè)孢子囊，每個(gè)孢子囊內(nèi)只發(fā)育出大孢子或小孢子，大小孢子異囊異葉，大小孢子葉相間排列（圖版Ⅰ，1）。在人工培養(yǎng)條件下，孢子囊隨孢子葉持續(xù)發(fā)生，不受自然條件的季節(jié)限制，在相應(yīng)的葉片伸長(zhǎng)生長(zhǎng)過程中完成減數(shù)分裂，并未發(fā)現(xiàn)同時(shí)發(fā)育有大小孢子的混生孢子囊。

中華水韭的兩種孢子囊在形態(tài)大小上都基本相同（圖版Ⅰ，2），小孢子囊幼嫩時(shí)為淺黃色，成熟后暗灰色（圖版Ⅰ，3），小孢子的平均產(chǎn)量是5．36×105個(gè)；大孢子囊幼嫩時(shí)為淺黃綠色（圖版Ⅰ，4），成熟后灰色（圖版Ⅰ，3），大孢子的平均產(chǎn)量是408個(gè)。

2．2 大小孢子囊的早期分化

當(dāng)中華水韭的個(gè)體從合子發(fā)育到約20枚葉片的幼植物體時(shí)，以后分化的每個(gè)葉片，其基部都發(fā)育出一個(gè)孢子囊，孢子囊的分化稍遲于葉原基的分化。當(dāng)每個(gè)葉原基的高度發(fā)育到2mm 左右時(shí)，孢子囊?guī)缀跖c葉片的維管束同步分化，孢子囊位于維管束的近軸面（圖版Ⅰ，5），稍呈截球形隆起，孢子囊的分裂能力較為旺盛，著色略深于葉片組織，此時(shí)的大小孢子囊在形態(tài)結(jié)構(gòu)上都很簡(jiǎn)單，沒有明顯的差別。當(dāng)葉片發(fā)育至1cm 長(zhǎng)短時(shí)，孢子囊隨著葉片的伸長(zhǎng)也向上下延長(zhǎng)，呈橢球形與葉片組織緊密相連，且向外明顯突起，但內(nèi)部的細(xì)胞還沒有明顯的分化（圖版Ⅰ，6）。其后孢子囊的突起速度顯著慢于上下延長(zhǎng)的速度，而且孢子囊隆起部分向周圍擴(kuò)展，孢子囊與葉片相連的面積顯著小于其表面積（圖版Ⅰ，7）。當(dāng)葉片長(zhǎng)度達(dá)到3cm 以上后，孢子囊在快速隆起的同時(shí)，內(nèi)部細(xì)胞也發(fā)生著明顯的分化，橫隔絲原始細(xì)胞及孢子母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)濃度不斷加深（圖版Ⅰ，8），但大小孢子囊的區(qū)別仍不明顯。

2．3 小孢子囊的發(fā)育

當(dāng)葉片長(zhǎng)度達(dá)到10cm 以上時(shí)，孢子囊內(nèi)染色較深的區(qū)域進(jìn)一步加深，大小孢子囊的特征逐漸顯現(xiàn)，首先會(huì)出現(xiàn)十多條橫隔絲及小孢子分生組織（圖版Ⅰ，9），最初的橫隔絲較寬、著色較深，細(xì)胞排列密集，其后，一些橫隔絲出現(xiàn)島嶼化溶解（圖版Ⅰ，10），小孢子母細(xì)胞的減數(shù)分裂幾乎是同步進(jìn)行，半數(shù)以上的小孢子囊敗育，所以產(chǎn)生的小孢子顏色較淺，胞質(zhì)透明（圖版Ⅰ，11），近半數(shù)的小孢子囊內(nèi)雖然產(chǎn)生了不少顏色較深、胞質(zhì)濃密的小孢子，但隔絲較粗壯（圖版Ⅰ，12）。在正常發(fā)育的小孢子囊內(nèi)，小孢子母細(xì)胞分裂旺盛，能迅速發(fā)育成四分體，而且遠(yuǎn)軸側(cè)的孢子囊壁較厚且不規(guī)則（圖版Ⅰ，13），近軸側(cè)的孢子囊壁與葉片維管束融為一體（圖版Ⅰ，14）。四分體密集，細(xì)胞核較大，著色較深（圖版Ⅰ，15），當(dāng)葉片長(zhǎng)度達(dá)到20cm 以上且不再伸長(zhǎng)后，小孢子囊內(nèi)四分體的中壁和外壁（周壁）才不斷形成（圖版Ⅰ，16）。小孢子囊無柄，也無明顯的開裂結(jié)構(gòu)。

2．4 大孢子囊的發(fā)育

在葉片長(zhǎng)度達(dá)到10cm 以上時(shí)，大孢子囊內(nèi)先出現(xiàn)少數(shù)橫隔絲（圖版Ⅰ，17）。大孢子母細(xì)胞為不整齊發(fā)育，即一些大孢子四分體已經(jīng)形成，一些大孢子母細(xì)胞還在減數(shù)分裂之中（圖版Ⅰ，18）。四分體各具有1個(gè)細(xì)胞核，胞質(zhì)染色較深（圖版Ⅰ，19）。有近半數(shù)的大孢子囊敗育，整個(gè)孢子囊內(nèi)除少數(shù)分化不完全的隔絲外，其余區(qū)域均近乎透明（圖版Ⅰ，20）。在近半數(shù)正常發(fā)育的大孢子囊內(nèi)，多數(shù)大孢子的四分體呈圓形（圖版Ⅰ，21），隨著大孢子的發(fā)育，內(nèi)含物不斷充實(shí)，三層孢子壁分化明顯（圖版Ⅰ，22）。也有少數(shù)大孢子囊外觀上與正常發(fā)育的基本相似（圖版Ⅰ，23），但其內(nèi)部的大孢子多數(shù)敗育，即孢子壁內(nèi)陷，內(nèi)含物較少（圖版Ⅰ，24）。大孢子囊的減數(shù)分裂發(fā)生在葉片伸長(zhǎng)生長(zhǎng)過程中，當(dāng)葉片停止生長(zhǎng)后，孢子壁才逐漸分化，敗育的大孢子囊要么萎縮干癟，要么基本類似于正常大孢子囊。大孢子囊無柄，也無明顯的開裂結(jié)構(gòu)，從切片上觀察，在可育的大孢子囊中，隔絲較粗，所占體積比例要明顯大于小孢子囊。

3 討 論

孢子囊既是現(xiàn)代蕨類植物學(xué)重要的分類原則之一，也是蕨類植物進(jìn)行無性生殖的唯一場(chǎng)所［12］，孢子囊的孢子產(chǎn)量一直是蕨類植物生殖方式的重要參考依據(jù) 。葉創(chuàng)興等 提出，水韭大、小孢子囊內(nèi)孢子的個(gè)數(shù)相差1 000倍，劉星［22］的統(tǒng)計(jì)顯示中華水韭大小孢子的直徑基本相差10倍，我們觀察到中華水韭兩種孢子囊的體積基本相等，這些似乎都支持葉創(chuàng)興的觀點(diǎn)。然而事實(shí)上，隔絲在可育大孢子囊內(nèi)所占的體積較大，在小孢子囊內(nèi)則相反，因此，小孢子的數(shù)量一定大于大孢子1 000倍，這一結(jié)論得到了本研究統(tǒng)計(jì)結(jié)果的支持。

幼期的小孢子囊有較粗的隔絲，以保證造孢組織的有絲分裂［17］。但小孢子囊內(nèi)的十多萬個(gè)小孢子母細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行減數(shù)分裂，此時(shí)若環(huán)境稍有改變，就很容易破壞小孢子的營(yíng)養(yǎng)供給從而造成敗育。中華水韭的孢子囊都是在葉片伸展時(shí)期即產(chǎn)地的初春季節(jié)進(jìn)行減數(shù)分裂，而該季節(jié)寒潮和干旱多發(fā)［23］。筆者認(rèn)為，環(huán)境因素引起的小孢子囊敗育應(yīng)該是導(dǎo)致中華水韭瀕危的一個(gè)重要原因。盡管大孢子母細(xì)胞的不整齊發(fā)育避開了偶然環(huán)境因素所導(dǎo)致的敗育環(huán)節(jié)，但近半數(shù)的隔絲一開始就發(fā)育不良，從根本上限制了大孢子母細(xì)胞的減數(shù)分裂，其必然性敗育的致危程度要大于小孢子囊的偶然性敗育。

筆者認(rèn)為多數(shù)植物學(xué)教科書［17］關(guān)于水韭屬植物最外圍是不育葉，向內(nèi)依次為大孢子葉和小孢子葉以及尚未分化的幼葉，這一描述存在不妥。據(jù)筆者觀察，中華水韭為多年生草本植物，既然存在大小孢子葉，“最外輪的葉片”也一定是可育葉，因?yàn)橛祖呙鐣r(shí)期的前幾十枚葉片很早就已脫落［10］。外輪葉片不斷隨其孢子囊的過熟而不斷脫落，內(nèi)部的孢子葉則逐漸由內(nèi)輪變成外輪，“外輪是大孢子葉”的結(jié)論只能是特殊時(shí)期的靜態(tài)描述。從生殖生態(tài)學(xué)的角度看，如果外一輪多枚葉片都具有相同的大孢子囊，那么這些大孢子囊間必然存在分化時(shí)間和成熟程度的不同，而導(dǎo)致內(nèi)一輪葉片的小孢子囊遠(yuǎn)不能及時(shí)分化和成熟，以致產(chǎn)生嚴(yán)重的雌雄不遇后果，進(jìn)而影響到有性生殖。觀察得出，中華水韭的大小孢子葉不存在外輪內(nèi)輪的單一孢子囊現(xiàn)象，大小孢子葉基本是隨機(jī)的相間排列。盡管單個(gè)小孢子囊同時(shí)成熟，單個(gè)大孢子囊不同時(shí)成熟，而每株中華水韭在一個(gè)生長(zhǎng)季可以成熟多枚大小孢子囊，因此，中華水韭不存在生殖演化上的缺陷，只是小孢子囊對(duì)環(huán)境的依賴性較強(qiáng)，且大孢子囊的敗育比例過高。

水韭的近緣植物石松屬（Lycopodium）和卷柏屬（Selaginella），多為旱生，孢子能借風(fēng)力進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，孢子囊都有固定的開裂結(jié)構(gòu)和方式［18］；卷柏屬的孢子囊還能通過基部細(xì)胞失水收縮而幫助孢子釋放 ，多數(shù)卷柏的大孢子囊都位于孢子葉穗的基部，易于被動(dòng)受精［15］，具有較高的繁殖能力。然而，水韭屬的大小孢子囊都不存在開裂結(jié)構(gòu)，也沒有固定的開裂方式，始終生長(zhǎng)在泥水里，只能通過孢子葉基部破裂或腐爛而釋放孢子［17］，這也應(yīng)該是導(dǎo)致中華水韭瀕危的原因之一。

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圖版Ⅰ 中華水韭大小孢子囊（b．大孢子囊；s．小孢子囊；Sp．孢子囊；Va．維管束）1．大孢子囊與小孢子囊在莖端的排布；2．成熟的孢子囊；3．發(fā)育良好的大孢子囊與小孢子囊；4．幼小的大孢子囊；5．孢子囊與葉原基的維管束；6．孢子囊向外隆起；7．孢子囊向上下延展；8．孢子囊內(nèi)部開始分化；9．小孢子囊的橫隔絲及分生組織；10．橫隔絲島嶼化溶解；11．?dāng)∮男℃咦幽遥?2．具粗壯隔絲的小孢子囊；13．正常發(fā)育的小孢子囊及其遠(yuǎn)軸側(cè)囊壁；14．正常發(fā)育的小孢子囊及其近軸側(cè)囊壁；15．小孢子囊內(nèi)的四分體；16．成熟中的小孢子；17．正常發(fā)育的大孢子囊；18．四分體形成中；19．大孢子四分體及造孢組織；20．?dāng)∮跗诘拇箧咦幽遥?1．可育的大孢子囊；22．正在成熟的大孢子；23．部分?jǐn)∮拇箧咦幽遥?4．?dāng)∮拇箧咦幽摇lateⅠ Sporangium of I．sinensis（b．Macrosporangium；s．Microsporangium；Sp．Sporangium；Va．Leaf primordium）Fig．1．Distribution of macrosporangium and microsporangium on the stem end；Fig．2．Mature sporangium；Fig．3．Well developed macrosporangium and microsporangium；Fig．4．Young macrosporangium；Fig．5．Sporangium and vascular bundle of leaf primordium；Fig．6．Sporangium hunch out；Fig．7．Sporangium is expanding；Fig．8．Internal structure differentiation in sporangium；Fig．9．Trabecula and meristem of microsporangium；Fig．10．Trabecula is dissolving；Fig．11．Abortive microsporangium；Fig．12．Microsporangium with thick trabecula；Fig．13．Normal developed microsporangium and its abaxial wall；Fig．14．Normal developed microsporangium and its adaxial wall；Fig．15．Tetrad in microsporangium；Fig．16．Mature microsporangium；Fig．17．Normal developed megasporangium；Fig．18．Tetrad forming；Fig．19．Tetrad of macrospore and sporogenous tissue；Fig．20．Megasporangium in early abortion；Fig．21．Fertile megasporangium；Fig．22．Developing megaspore；Fig．23．Partly abortive megasporangium；Fig．24．Abortive megasporangium．