姚家奎,王曉鈴,柏斗勝,孫長江

(揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州,225001)

消化道惡性腫瘤是我國腫瘤患者死亡的主要原因之一,嚴(yán)重危害人民健康,其主要治療手段是外科手術(shù),但大多數(shù)患者就診時(shí)已屬中晚期,化療和放療技術(shù)的發(fā)展提高了腫瘤外科根治切除術(shù)后的療效,又為不能實(shí)施手術(shù)切除患者提供了一個(gè)新的治療途徑。目前盡管腫瘤化療取得了一些進(jìn)展,但由于在不同種族人群中,不同個(gè)體間仍有顯著的化療有效率、毒性反應(yīng)的異質(zhì)性。據(jù)有關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),目前應(yīng)用的抗腫瘤藥物對至少70%的患者療效有限,20～40%患者甚至有可能接受了錯誤的藥物治療;據(jù)美國癌癥協(xié)會估計(jì),90%以上的患者死于不同程度的腫瘤細(xì)胞耐藥性,因此逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性,提高化療藥物的敏感性對癌癥的治療具有積極意義[1]。隨著藥物基因組學(xué)以及在此基礎(chǔ)上發(fā)展的蛋白組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等高通蛋白和超高通技術(shù)的出現(xiàn),使臨床醫(yī)師和分子生物學(xué)家很快就找到了共同的關(guān)注點(diǎn),即從個(gè)體基因組中分析和鑒定患者之間存在的疾病相關(guān)的個(gè)體差異,并利用這些差異來合理地篩選藥物指導(dǎo)臨床治療。本文就消化道腫瘤患者化療藥物基因組學(xué)基因型進(jìn)行了分析,以便對選擇化療藥物個(gè)性化治療進(jìn)行指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

病例選擇2007年1月～2010年10月在本院住院就診患者共35例,其中胃癌15例;腸癌6例;食道癌4例;胰腺癌6例;膽管癌2例;膽囊癌2例。男性19例,女性 16例;最大年齡 70歲,最小年齡45歲,平均59歲。所有手術(shù)后標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查確診。

1.2 試劑與TaqMan等位基因檢測及分型方法

所有患者化療前抽取血液標(biāo)本2.0 mL注入EDTA抗凝管,充分混勻后待測相關(guān)基因型。應(yīng)用血液基因組DNA快速抽提純化試劑盒(Promega,USA)提取基因組DNA,基因分型采用美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)生產(chǎn)的SNP基因分型試劑盒及TaqMan PCR混合試劑盒。PCR反應(yīng) 體 系 為 25 μ L,包 括:TaqMan UniversaL PCR Master Mix(AppLied Biosystems,Foster City,CA,USA)12.5 μ L,20 ×TaqMan SNP Genotyping Assay Mix 1.25 μ L,25 μ g/mL 的基因組 DNA 2 μ L,超 純 水 9.25 μ L。 在ABI7000PCR儀擴(kuò)增:95℃10 min激活Mix里的金牌DNA擴(kuò)增酶;繼而92℃15 s變性,60℃1 min退火及延伸,共40個(gè)循環(huán)。ABI3130DNA測序儀分析SNP分型結(jié)果。為保證基因分型的準(zhǔn)確性,所有檢測標(biāo)本均由另一操作者進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn),結(jié)果與第1次完全一致。

2 結(jié) 果

基因分型及突變類型35例消化道惡性腫瘤患者檢測結(jié)果:T/T基因型11例(11/35);G/A基因型5例(5/35);A/A基因型8例(8/35);I/V基因型3例(3/35);V/V基因型4例(4/35);R/R基因型4例(4/35)。

3 討 論

隨著人類基因組計(jì)劃的完成以及對腫瘤化療藥物應(yīng)用研究的發(fā)展,人們逐漸認(rèn)識到個(gè)體基因的差異,最為常見的差異就是單核苷酸多態(tài)性(SNP)。發(fā)現(xiàn)一些藥物的毒副作用和這些位點(diǎn)緊密相關(guān),其主要機(jī)理是若干位點(diǎn)的變化使藥物代謝基因的活性下降,有些則直接造成該基因活性的喪失,從而使藥物代謝產(chǎn)生障礙引起一系列嚴(yán)重的化療毒副作用。因此,如果能對這些基因位點(diǎn)進(jìn)行檢測,預(yù)測藥物是否將對病人產(chǎn)生不良作用,實(shí)現(xiàn)化療藥物的針對性、個(gè)體化用藥,就能從根本上緩解病人痛苦,提高病人在化療過程中的生存概率。所以,腫瘤治療的個(gè)性化越來越受到醫(yī)學(xué)界的重視,臨床開展治療前基因型篩選更具有重要意義。

5-氟尿嘧啶(5-FU)是尿嘧啶的類似物在人體內(nèi)代謝成5-氟去氧尿嘧啶(F-dump)后,與胸腺嘧啶合成酶(TS)形成穩(wěn)定化合物,抑制TS功能,由于該酶負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)的去氧單磷酸尿苷(dUMP)轉(zhuǎn)化成去氧單磷酸腺苷(dTMP),一旦它的功能被抑制,將細(xì)胞內(nèi)的唯一dTMP合成途徑被截?cái)?導(dǎo)致其含量不足,影響細(xì)胞復(fù)制DNA的合成,進(jìn)而將細(xì)胞生長抑制在細(xì)胞周期中的DNA合成前期(即G1期、S期之間),以達(dá)到殺死癌細(xì)胞的目標(biāo)。通過MTHFR(C677T)多態(tài)性基因檢測,預(yù)測5-FU治療的療效,T/T等位基因較其他基因型要敏感,療效好;與腫瘤化療藥物代謝相關(guān)的二氫嘧啶脫氫酶(DPD),是另一種主要參與嘧啶分解代謝的酶,DPD是常用化療藥物5-FU以及口服嘧啶類化療藥物的代謝限速酶,其活性在人群中存在個(gè)體差異,進(jìn)入體內(nèi)的5-FU80%是經(jīng)由DPD代謝清除,在5-FU分解代謝中起關(guān)鍵作用。該酶失活影響5-FU這種藥物的分解代謝,造成治療過程中有毒藥物在體內(nèi)的積累,引起嚴(yán)重的毒副反應(yīng)。該基因突變型的癌癥患者接受5-氟尿嘧啶治療即會產(chǎn)生強(qiáng)烈的毒副作用甚至死亡。許多研究表明臨床上可以見到DPD酶活性部分或完全缺乏的患者接受5-FU化療后療效明顯,但出現(xiàn)嚴(yán)重毒副作用,DPD酶活性受DPD酶基因(DPYD)多態(tài)性的影響,而基因多態(tài)性>90%的表現(xiàn)形式為單核苷酸多態(tài)性(SNP)[2]。SaLgueiro等[3]的研究表明,DPYD基因14外顯子的突變與相當(dāng)部分5-FU相關(guān)嚴(yán)重毒副反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)。為提高這類藥物的療效同時(shí)預(yù)防和減少其毒副反應(yīng),更好地實(shí)現(xiàn)5-FU及嘧啶類藥物的個(gè)體化治療.通過DPD＊2A多態(tài)性基因檢測,預(yù)測對患者毒副作用,G/G型不增加毒副作用,G/A及A/A增加患者發(fā)生不良反應(yīng)的危險(xiǎn)性。DPYD的SNP檢測具有重要的臨床意義。據(jù)有關(guān)研究報(bào)道使用5-FU治療而發(fā)生毒性副作用的腸癌患者中約有17%～57%帶有DPD＊2A基因型,可見此SNP影響了DPD活性表現(xiàn),DPD活性高低直接決定了5-FU進(jìn)入合成代謝和產(chǎn)生核苷酸類似物的量,藥代動力學(xué)研究也顯示DPD活性缺乏可導(dǎo)致5-FU體內(nèi)清除受阻,半衰期顯著延長,分解減弱而合成增加,細(xì)胞毒性也相應(yīng)增強(qiáng)。因此若能在5-FU治療前先行檢測患者是否帶有DPD＊2A,將可以預(yù)測5-FU治療的副作用,若是檢測發(fā)現(xiàn)患者帶有此SNP,則可避免使用5-FU治療,若無法避免則應(yīng)于患者接受治療后密切追蹤其治療反應(yīng)。作者還通過MTHFR(C677T)多態(tài)性基因檢測了解MTX(甲氨喋呤)毒副作用,T/T等位基因較其他基因型毒副作用增加。

GSTs(谷胱甘肽轉(zhuǎn)移S酶類)為人體內(nèi)最重要的Ⅱ相代謝酶,它是一組超基因家族蛋白,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有 4種類 型:α(GSTA)、π(GSTP)、μ(GSTM)、θ(GSTT),其主要分布于消化、呼吸道等處上皮。該酶的作用主要催化還原谷胱甘肽與許多具有遺傳毒性的復(fù)合物結(jié)合,增加水溶性,利于毒物從尿和膽汁排泄,在多數(shù)情況下是一種解毒過程;具有間接誘導(dǎo)DNA修復(fù),維持細(xì)胞基因組完整性的作用,是細(xì)胞抗損傷、抗癌變的主要解毒系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)GSTs過度表達(dá)與腫瘤耐藥相關(guān),特別是與鉑類藥物的耐藥性關(guān)系密切[1]。GSTs基因多態(tài)性不僅與肺癌、腸癌等腫瘤遺傳易感性有關(guān),其活性變化還與惡性腫瘤對化療藥物的敏感性相關(guān),導(dǎo)致GST活性下降的遺傳變異會增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性[4-6]。GSTP1是GST家族的主要成員,它在肝臟組織中有較高表達(dá),其基因多態(tài)已被證實(shí)可導(dǎo)致GSTP1酶活性顯著降低;當(dāng)導(dǎo)入外源性GSTP1基因或在誘導(dǎo)癌細(xì)胞耐藥過程中細(xì)胞表達(dá)GSTP1時(shí),細(xì)胞內(nèi)的化療藥物特別是鉑類藥物的貯留量則明顯減少。所以,認(rèn)為GSTP1可能是抗藥性的標(biāo)志之一,與腫瘤細(xì)胞對抗癌藥耐受性的獲得有關(guān)。STOEHLMACHER等[7]研究結(jié)果證實(shí),GSTP1 ILe105VaL基因多態(tài)性可能與晚期結(jié)直腸癌病人對鉑類化療藥物療效相關(guān)。通過檢測GSTM1多態(tài)性,缺失型的較其他基因型要敏感,療效好;GSTP1(I105V)基因,I/V,V/V等位基因較其他基因型要敏感,療效好。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用TaqMan-MGB探針等位基因分型技術(shù)檢測GSTP1基因I105V的多態(tài)性,分析消化道惡性腫瘤病人基因多態(tài)性與應(yīng)用鉑類為基礎(chǔ)的藥物化療后療效的關(guān)系,可用于指導(dǎo)該類藥物的個(gè)體化使用,提高臨床治療的針對性和可預(yù)見性。

XRCC1(X線交錯互補(bǔ)修復(fù)基因1)是一種與DNA單鏈損害堿基切除修復(fù)直接相關(guān)的蛋白質(zhì),其至少包括3種常見的遺傳多態(tài)性,其中Arg399※GLn變異在腸癌中最為常見,其發(fā)生與DNA損害標(biāo)志物水平上升有關(guān)。作者通過XRCC1(R399Q)多態(tài)性檢測到4例R/R等位基因。對于患者化療藥物療效,R/R等位基因較其他基因型(R/Q、Q/Q)敏感、療效好。近年來國內(nèi)相關(guān)研究顯示,胃癌患者XRCC1多態(tài)性與療效有關(guān)[8]。國外研究表明XRCC1基因的多態(tài)性可預(yù)測鉑類化療藥物治療轉(zhuǎn)移性腸癌療效,StoehLmacher等[9]研究了61例接受奧沙利鉑聯(lián)合5-FU治療的轉(zhuǎn)移性腸癌患者XRCC1基因密碼子399多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。研究發(fā)現(xiàn)了位于10號外顯子的R399Q的多態(tài)性,在11例有效的病例中,有8例(73%)是RR基因型,3例(27%)是雜合子(RQ);在 10例進(jìn)展的病例中,3例(30%)是QQ變異基因型而5例(50%)是雜合子;穩(wěn)定的病例中,15例(38%)是R等位基因的純合子,23例(58%)是雜合子,2例(4%)是Q等位基因的純合子。

總之,由于藥物在體內(nèi)敏感性影響因素復(fù)雜,目前腫瘤患者化療藥物基因型測定研究的真正目的可能不在于篩選哪些藥物在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)更為敏感,而在于篩選體內(nèi)應(yīng)用時(shí)可能不敏感的藥物,以避免盲目化療可能導(dǎo)致的毒性反應(yīng)。所以化療前及化療過程中動態(tài)檢測藥物敏感性和抗藥性,是實(shí)現(xiàn)化療個(gè)體化和提高療效的重要基礎(chǔ),合理選擇化療藥物,可有效延長癌癥患者生存期和避免患者不必要的身體和經(jīng)濟(jì)上的負(fù)擔(dān)。

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