溫 迪，于秀軍，2，郭艷蘇，2*

(1河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院，石家莊050000;2河北省神經病學重點實驗室)

組蛋白去乙?；?HDACs)的主要功能是去除組蛋白N-末端的賴氨酸殘基乙?；糠郑谷旧|變得致密，從而抑制基因轉錄。但是有些HDACs，例如HDAC6，也能夠影響細胞內非組蛋白的功能。研究顯示，HDAC6參與細胞內自噬的降解過程［1］，自噬是包括人在內的真核生物共有的一種高度進化保守機制，調節(jié)細胞質長壽命蛋白、損傷的細胞器以及異常蛋白聚集物的更新和重復利用。研究HDAC6與自噬的關系將為神經變性疾病的治療提供新的線索。

1 HDAC家族的分類及定位

HDAC是1個大的酶家族，其成員目前已知有18個不同的亞型，根據(jù)種系發(fā)生和系列同源性分為4大類:Ⅰ(HDAC 1、2、3和8)、Ⅱ(HDAC 4、5、6、7、9和10)、Ⅲ(SIRT1～SIRT7)和Ⅳ(HDAC11)。其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ為經典家族，是Zn2+-依賴性的HDAC。Ⅰ類HDACs主要與酵母的轉錄因子yRPD3相互作用，在不同的發(fā)育階段、不同的組織和細胞類型中廣泛表達，主要定位在細胞核［2］。Ⅱ類HDACs具有組織和時期特異性，HDAC6主要定位于細胞質，而HDAC 4、5、7和9主要穿梭于細胞核與細胞質之間，只在部分組織細胞中表達。Ⅲ類HDACs屬于Sirtuin家族，是酵母SIR2蛋白在哺乳動物中的相似物，它不使哺乳動物的組蛋白去乙酰化，不屬于經典的HDACs，是NAD+-依賴的去乙?；福?］。

2 HDAC6的分子結構及作用

HDAC6基因定位于X染色體p11.22-23區(qū)帶，約21 923 bp，由位于41～677 bp間的28個外顯子編碼。從蛋白質結構來講，HDAC6含有1 216個氨基酸，是目前發(fā)現(xiàn)的人類最大的蛋白質。HDAC6獨特地擁有兩個高度同源的催化區(qū)域:一個起始于第215位氨基酸，另一個起始于第610位，而且均含有一個與泛素結合的富含半胱氨酸和組氨酸的鋅指結構區(qū)域。C-末端的鋅指結構區(qū)既能與泛素化的錯誤折疊蛋白結合，又能與肌動蛋白結合。體外去乙酰基活性位點主要位于C'端第二催化區(qū)域，即H611A。體內HDAC6主要分布于胞質、核周結構和細胞的生長前沿區(qū)，與包含p150的動力復合物相互作用。HDAC6在心、肝、腎、腦、胰腺等臟器中高表達，是一種胞內酶，具有泛素結合功能和去乙?；富钚?，它與底物［α-微管蛋白、HSP90和cortactin］相互作用并使之去乙酰化。通過這些相互作用，HDAC6調節(jié)許多重要的生物過程，包括細胞遷移、微管穩(wěn)定性、胞內運輸、免疫突觸形成以及錯誤折疊蛋白的降解［4］。

3 自噬

自噬能清除細胞內過多或異常的蛋白質、細胞器，甚至病原微生物，不僅有利于維持細胞穩(wěn)態(tài)，也促進氨基酸等的再循環(huán)，為多種生化進程提供底物或原料。根據(jù)自噬底物進入溶酶體的途徑不同，自噬分為:①巨自噬:細胞質中可溶性蛋白和變性壞死的細胞器被囊泡樣雙層膜結構的自噬體包裹后，自噬體通過細胞骨架微管系統(tǒng)運輸至溶酶體，與之融合成自噬溶酶體進行降解;②微自噬:溶酶體膜自身發(fā)生內陷，直接將底物攝入溶酶體進行降解;③分子伴侶介導的自噬:分子伴侶Hsc-70識別底物蛋白分子的特定氨基酸序列并與之結合，形成分子伴侶—底物復合體，然后與溶酶體相關膜蛋白2A型受體結合進入溶酶體降解［5］。自噬主要由自噬相關基因(Atg)編碼的蛋白完成。從低等生物到高等生物，大部分Atg為高度保守性。Atg5和Atg6(beclin1)被證明是巨自噬和微自噬的必要基因標志，而溶酶體受體則被認為是分子伴侶介導的自噬標志。LC3是酵母 Atg8(Aut7/ Apg8)在哺乳動物的同系物，可作為自噬體的標記蛋白。

基礎的質量控制性自噬是不依賴于營養(yǎng)的“基本的”自噬，主要功能是通過選擇性地對蛋白質聚集體和損壞的細胞器(包括線粒體)的處理，加強細胞內的質量控制，對蛋白和細胞器的回收利用很重要。特異性地去除小鼠神經元的Atg5和Atg7，導致了泛素陽性的蛋白聚集以及神經元的進一步丟失，充分闡釋了自噬的這一活性。饑餓和應激誘導的自噬非選擇性地降解細胞質內容物以及細胞器，為細胞提供生存的大分子和能量，促進細胞存活，超出安全范圍則導致細胞死亡。研究顯示，盡管質量控制自噬和饑餓誘導的自噬共享依賴于溶酶體降解細胞質組分的共同Atg機制，但二者在功能、本質和底物特異性上是不同的［6］。

4 HDAC6與聚集體的形成

錯誤折疊及聚集的蛋白是許多年齡相關或遺傳性神經變性疾病共有的病理學標志，包括阿爾茨海默病、帕金森疾病、肌萎縮側索硬化和多谷氨酰胺疾病等［7］。錯誤折疊蛋白不僅沒有功能，還能夠形成干擾細胞功能的聚集物。因此，錯誤折疊蛋白被嚴密監(jiān)督、處理以及降解，以防止在細胞內堆積。

通常情況下錯誤折疊蛋白被泛素化從而被蛋白酶體降解。當?shù)鞍酌阁w活性被抑制時錯誤折疊蛋白聚集形成聚集體，聚集體的形成是細胞保護性反應的一部分，是清除細胞內毒性的錯誤折疊蛋白的關鍵，通常和神經變性疾病中細胞的死亡相關。聚集體的形成有兩種功能:將錯誤折疊蛋白濃集形成聚集體從細胞質中去除，阻止廣泛的細胞內毒性反應;通過微管組織中心為靶點的蛋白分解裝置(包括自噬)，有效地降解毒性蛋白。

HDAC6通過去乙酰化酶活性和泛素結合活性參與聚集體的形成，聚集體分為泛素陽性和泛素陰性，HDAC6通過C-末端鋅指結構區(qū)選擇性地和泛素陽性的聚集體結合。HDAC6和動力蛋白復合物的組分p150相關，通過鄰近第二催化區(qū)域的第65位氨基酸多肽與動力蛋白結合，將泛素陽性的蛋白募集至動力蛋白，形成泛素陽性蛋白-HDAC6-動力蛋白三聚體，沿著微管轉運至微管組織中心，中間絲細胞骨架包繞三聚體形成聚集體［8］。實驗表明，在敲除HDAC6的細胞中，錯誤折疊的蛋白聚集物不能形成聚集體;用MG-132誘導聚集體形成，再引入無催化活性或泛素結合缺陷的突變體HDAC6，都不能形成聚集體，但是可以在細胞質中形成小的泛素化微團聚體，而蛋白聚集物則不能轉運至微管組織中心被降解［6］。這些結果說明聚集體的形成需要HDAC6，并且依賴于它的去乙?；富钚院头核亟Y合活性。

在熱休克反應通路中，HDAC6通過泛素結合活性調節(jié)HSP90-HSF1復合物的分離，正常情況下，HSP90維持HSF1處于無活性狀態(tài)。在熱休克途徑或蛋白酶體抑制的情況下，HDAC6的泛素結合能力將蛋白酶體功能障礙的信號傳遞給HSP90-HSF1復合物，誘導HSF1轉錄因子的釋放和活化，依次激活應答的HSP基因，導致主要的分子伴侶HSP70和HSP27聚集，對錯誤折疊蛋白聚集物作出反應。HSP降低了錯誤折疊蛋白的毒性，增加細胞內分子伴侶的表達，使蛋白分解或者再折疊轉運至蛋白酶體被降解［9］。

p97/VCP是AAA ATP酶家族的分子伴侶，與泛素蛋白酶體途徑相關，具有分離酶活性，可以使HSP90-HSF1復合物分離。研究顯示p97/VCP是HDAC6的配偶體，HDAC6的泛素結合活性可以使 HDAC6-p97/VCP復合物分離［10］。HDAC6和p97/VCP之間的平衡決定了泛素化的蛋白是被降解還是形成聚集體，因為p97/VCP促進了蛋白酶體介導的蛋白質降解，而HDAC6促進了泛素化蛋白聚集形成聚集體。然而，在p97/VCP突變細胞中聚集體形成受損，提示HDAC6和p97/VCP在聚集體形成中的相互聯(lián)系。p97/VCP參與恢復活化的HDAC6以及再形成HSP90-HSF1復合物，可以推測p97/VCP對于 HDAC6的重復利用起著至關重要作用［11］。

5 HDAC6與聚集體的降解即自噬過程

聚集的蛋白具有細胞毒性，有效地處理錯誤折疊的蛋白對細胞活力十分必要，這一過程需要三個相互聯(lián)系的通路:分子伴侶機制輔助蛋白折疊;蛋白酶體途徑降解錯誤折疊的蛋白;聚集體途徑將毒性蛋白分離以及傳遞給自噬細胞而清除。蛋白聚集物的堆積通過阻塞蛋白酶體或其他間接的機制抑制蛋白酶體活性，導致聚集的錯誤折疊蛋白進一步堆積。事實上不能降解錯誤折疊和聚集的蛋白對許多神經變性疾病的神經細胞死亡起主導因素［12］。

自噬體包含的HDAC6產生信號募集自噬組分，同時自噬體外的HDAC6與動力蛋白、Atg8和Atg12之間存在相互聯(lián)系。但是HDAC6并不是唯一的調節(jié)自噬募集的蛋白，最近研究表明，另一種泛素結合蛋白p62也參與調節(jié)自噬體向蛋白聚合物的募集反應，p62和自噬蛋白LC3結合，這一過程是不依賴于 HDAC6的［10］。質量控制的自噬需要HDAC6，但是在饑餓誘導的自噬中HDAC6卻是可有可無的，這一發(fā)現(xiàn)顯示自噬的調節(jié)是有差別的。在自噬底物中HDAC6招募并且激活了一個肌動蛋白重塑因子cortactin，HDAC6為泛素化蛋白聚集體補充cortactin，使動力蛋白重塑，從而促進了融合事件［8］，表明質量控制的自噬包括微管依賴的運輸和肌動蛋白依賴的融合。在兩個過程中，HDAC6起著重要作用，HDAC6和p62獨立地識別并且結合蛋白聚集體或其他質量控制自噬底物的特異泛素成分，它們招募并裝配自噬的必需成分，包括自噬體、溶酶體和肌動蛋白網狀結構。通過從底物中濃縮自噬的成分，刺激自噬體和溶酶體的融合，激活質量控制的自噬，特異和高效地完成蛋白聚集體和損傷細胞器的清除。

由于自噬體缺乏內在酶活性，因此自噬體與溶酶體的融合對于有效的自噬是十分關鍵的。使用pH敏感的mCherry-GFP-LC3報告基因來檢測融合效率，結果表明在正常營養(yǎng)條件下有效的自噬體和溶酶體的融合需要HDAC6。為了獲得更多HDAC6直接調節(jié)自噬體和溶酶體融合的證據(jù)，進一步在體外測定分析它們的融合效率。盡管體外測定不能夠區(qū)分HDAC6敲除的小鼠胚胎成纖維細胞(MEFS)自噬體和溶酶體的融合缺陷是否由于對接、圈合或自身膜融合的不足，但是進一步提供了自噬體和溶酶體有效融合需要HDAC6的證據(jù)［6］。

自噬體和溶酶體的融合缺陷預示著自噬體的聚集。體內和體外的融合測定和形態(tài)測定分析均支持HDAC6在自噬體和溶酶體的融合中起著重要作用，通過自噬流量分析和p62的聚集測定進一步證實了這一結論。在HDAC6敲除的MEFS中，溶酶體融合缺陷導致自噬體集聚。在阿爾茨海默病患者營養(yǎng)障礙的軸突和額顳葉癡呆小鼠模型也發(fā)現(xiàn)了相似的異常自噬結構的顯著聚集［6］。研究發(fā)現(xiàn)，敲除HDAC6的小鼠和敲除HDAC6的轉基因果蠅均出現(xiàn)泛素陽性的聚集體，產生了自發(fā)的神經變性。然而，缺乏HDAC6并不影響自噬的激活，而是使自噬體—溶酶體融合受損。這一發(fā)現(xiàn)強調了自噬體—溶酶體融合缺陷和神經變性疾病進展的因果關系。如果這一假說是正確的，使用融合促進劑促進有效的自噬可能是治療神經變性疾病最有效的方法［13］。

6 小結

HDAC6是一種罕見的去乙酰化酶，以細胞質定位、泛素結合能力、對動力蛋白和肌動蛋白細胞骨架產生影響為特征。此外，HDAC6能促進錯誤折疊蛋白的降解，故選擇性地抑制HDAC6可以嚴重地破壞細胞處理錯誤折疊蛋白的能力，導致細胞內的蛋白“垃圾”迅速積累，進而誘發(fā)細胞凋亡。如果在神經變性疾病中，蛋白聚集物的毒性是神經元功能障礙以及死亡的基礎，通過增強自噬以清除蛋白聚集物將是這一疾病合理的治療方法。雷帕霉素的抗神經變性活性為這一觀點提供了證據(jù)［13］。Nixon等報道在阿爾茨海默病患者腦組織中，發(fā)現(xiàn)不正常、非成熟的自噬體堆積。據(jù)此推測患者體內自噬體和溶酶體的融合可能受損。同樣，自噬體與溶酶體融合缺陷可能與CHMP2B突變引起的家族性額顳葉癡呆有關。自噬體和溶酶體融合缺陷在神經變性疾病中的普遍性可能為探索有效治療方法提供潛在的靶點，而HDAC6直接調節(jié)自噬體和溶酶體融合。試想，聯(lián)合應用自噬激活劑和融合助催化劑可能會更有效地清除蛋白聚集物，為神經變性疾病提供新的治療方法［6］。

［1］Rubinsztein DC.The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration［J］.Nature，2006，443(7113):780-786.

［2］Nazanin M，Brad EM，Santosh RD.ClassⅡA HDACS in the regulation of neurodegeration［J］.Front Biosci，2008，13:1072-1082.

［3］Bertrand P.Inside HDAC with HDAC inhibitors［J］.Eur J Med Chem，2010，45(6):2095-2116.

［4］Yoshiharu K，Jeffrey JK，Adam M，et al.The deacetylase HDAC6 regulates aggresome formation and cell viability in response to misfolded protein stress［J］.Cell，2003，115(6):727-738.

［5］Orenstein SJ，Cuervo AM.Chaperone-mediated autophagy:molecular mechanisms and physiological relevance［J］.Seminars in Cell＆Developmental Biology，2010，21(7):719-726.

［6］Lee JY，Koga H，Kawaguchi Y，et al.HDAC6 controls autophagosome maturation essential for ubiquitin-selective quality-control autophagy［J］.Embo J，2010，29(8):969-980.

［7］Udai BP，Yakup B，Eric H，et al.HDAC6 at the intersection of autophagy，the ubiquitin-proteasome system and neurodegeneration［J］.Autophagy，2007，3(6):643-645.

［8］Iwata A，Riley BE，Johnston JA，et al.HDAC6 and microtubules are required for autophagic degradation of aggregated Huntingtin［J］.J Biol Chem，2005，280(48):40282-40292.

［9］Patrick M，Minoru Y，Saadi K.HDAC6 a new cellular stress surveillance factor［J］.Cell Cycle，2008，7(1):7-10.

［10］Seigneurin-Berny D，Verdel A，Curtet S，et al.Identification of components of the murine histone deacetylase 6 complex:link between acetylation and ubiquitination signaling pathways［J］.Mol Cell Biol，2001，21(23):8035-8044.

［11］Guiping D，Renjie J.To prevent neurodegeneration HDAC6 uses different strategies for different challenges［J］.Landes Bioscience，2011，4(2):139-142.

［12］Bennett EJ，Shaler TA，Woodman B，et al.Global changes to the ubiquitin system in Huntington’s disease［J］.Nature，2007，448 (7154):704-708.

［13］Pandey UB，Nie Z，Batlevi Y，et al.HDAC6 rescues neurodegeneration and provides an essential link between autophagy and the UPS［J］.Nature，2007，447(7146):859-863.